Порядок проведения санитарно-бактериологических исследований пищевых продуктов

При плановом санитарно-бактериологическом контроле пищевых продуктов подлежат исследованию:

- количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (МАФАнМ) - (общее количество микробов)*;

- количество бактерий группы кишечных палочек (БГКП)**, а в части продуктов - количество БГКП методом наиболее вероятного числа (НВЧ);

* - Общее количество микробов не определяет в продуктах, содержащих специфическую микрофлору: кисломолочных продуктах, заправленных салатах; винегретах с квашенными овощами, поскольку подсчёт бактерий в таких случаях не может быть показательным.

**- В тех случаях, когда коли-титр меньше 1, целесообразно характеризовать обсемененность исследуемого жидкого продукта в виде коли-индекса.

- коагулазоположительные стафилококки (St.aureus);

- бактерии рода Proteus;

- бактерии рода Salmonella в 25 г продукта.

Количество мезофильных аэробных и факулътативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАнМ), количество бактерий группы килечных палочек, St. aureus и Proteus определяют нижеизложенными методами. Исследование на отсутствие или наличие сальмонелл проводится в соответствии о действующей "Инструкцией о порядке расследования, учёта и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых отравлениях", № 1135-73.

Содержание или отсутствие в определенной массе исследуемого продукта вышеперечисленных микроорганизмов должно соответствовать нормативам, изложенным во "Временных указаниях по микробиологическим нормативам для ряда особо скоропортящихся пищевых продуктов и методам их исследования" № 2510-81. При наличии ГОСТа на методы бактериологического анализа (например, ГОСТ 9958-81 «Изделия колбасные и продукты из мяса») анализ проводят в соответствии с ГОСТ, а для оценки качества продуктов пользуются "Временными указаниями" № 2510-81.

В тех случаях, когда по ГОСТу используется для анализа навеска продукта, превышающая норматив, (например, в ГОСТ 9958-81 бактерии группы кишечных палочек в зельцах определяют в I г, а во "Временных указаниях" № 2510-81 норматив для зельца белого I с и серого II с - отсутствие БГКП в 0,5 г), то делается заключение о соответствии качества продукции по микробиологическим показателям, если БГКП не обнаруживаются в I г продукта.

Если БГКП обнаруживают в I г, то бактериолог СЭС имеет право сделать посев навески массой 0,5 г.

При разработке ГОСТов на негостированную продукцию общественного питания и пересмотре действующей нормативно-технической документации необходимо руководствоваться методами, изложенными в настоящих «Методических указаниях».

3.1. Подготовка проб пищевых продуктов к бактериологическому исследованию

Пищевые продукты подразделяются по физическим свойствам на плотные и жидкие, следовательно, и способы обработки их перед исследованием должны быть различными. Перед исследованием пробы вначале подготавливают навеску, которая должна охарактеризовать всю доставленную пробу. Навески продукта берут в условиях бокса стерильно из разных мест пробы, с поверхности и из глубины.

Подготовка навески проб пищевых продуктов, на которые имеется ГОСТ на методы исследования, осуществляется в соответствии с требованиями последних.

Для продуктов, не имеющих ГОСТ на методы исследования (вторые блюда, гарниры, каши, винегреты), отбирают навеску в количестве 15 г на технических весах 1 класса из усредненной пробы.

Навеску плотных продуктов растирают в стерильной фарфоровой ступке с песком или гомогенизируют в микроразмельчителе тканей с постепенным добавлением 135 мл 0,1% раствора пептона в воде или изотонического раствора хлорида натрия и оставляют при комнатной температуре на 15 минут. Затем для посевов взвесь отбирают стерильной пипеткой с широким концом. Принимается, что I мл приготовленной взвеси содержит 0,1 г исходного продукта.

Продукты жидкой консистенции - молоко, компоты, напитки, изготовленные в объектах общественного питания, засевают без предварительной обработки; пищевые продукты, имеющие кислую реакцию (рП 4,0-6,0), перед исследованием нейтрализуют стерильным 10% раствором двууглекислого натрия до слабощелочной реакции (рН 7,2-7,4). Реакцию среды проверяют с помощью рН-метра или по универсальной индикаторной бумаге.

Для исследования на сальмонеллы из усредненной пробы отбирается отдельная навеска массой 25 г.

3.2. Приготовление разведений пищевых продуктов для посева

Для пищевых продуктов жидкой и полужидкой консистенции, не требующих предварительного размельчения и растирания, разведения готовят следующим образом:

Берут ряд пробирок (обычно не более 5-ти), каждая пробирка должна содержать 9,0 мл стерильного 0,1% водного раствора пептона или изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку стерильной градуированной пипеткой вносят 1,0 мл исследуемого продукта, затем новой стерильной пипеткой после весьма тщательного перемешивания содержимое 1-й пробирки в количестве I мл переносят в следующую пробирку, не прикасаясь к поверхности жидкости в этой пробирке и т.д.

В результате исследуемый продукт оказывается разведенным в 10, 100, 1000 и более раз в соответствии с количеством взятых пробирок. I мл взвеси в первой пробирке содержит 0,1 г (мл) продукта (1-е разведение), во второй пробирке - 0,01 г (мл) продукта (2-е разведение) и так далее.

При исследовании пищевых продуктов плотной консистенции в качестве первого разведения используют 10%-ю взвесь, полученную после механической обработки продукта в ступке или гомогенизаторе, описанным выше способом (п.4.1).

3.3. Метод определения количества мезофильных аэробных и

факультативно анаэробных микроорганизмов в I г (мл) продукта - (Общее микробное число - ОМЧ) - "МАФАнМ"

Метод основан на способности мезофильных аэробов и факультативных анаэробов расти на питательных средах определенного состава при температуре 30°С с образованием колоний, видимых при увеличении в 2 раза.

Для определения количества мезофильных бактерий следует выбирать разведения, при посеве которых на чашках вырастают не менее 30 м не более 300 колоний.

Из каждой пробы делают посев глубинный методом на 2 параллельные чашки Петри на 2-3 последовательных разведений в количестве 1,0 мл, используя для этого 2%-й агар, приготовленные ни сухого питательного агара (см. стр. 44). Контролировать температуру надежнее в пробе, если агар разливают небольшими порциями в пробирки (12-15 мл). Агар в пробирках быстрее расплавляется и охлаждается более равномерно до нужной температуры. Чашки заливают расплавленным и остуженным до 45°С агаром сразу же после внесения материала. В противном случае может наблюдаться неравномерное распределение колоний в виде отдельных скоплений в толще агара; для более равномерного распределения посевного материала, кроме того, содержимое чашки перемешивают вращательными движениями.

После застывания агара чашки с посевами держат в термостате днищем вверх, инкубируют по рекомендации ФАО/НОЭ при 30^оС в течении 72 часов; при необходимости предварительный учет производят через 48 часов. Количество колоний подсчитывают на каждой из посеянных чашек. Счет колоний на чашках производят с помощью прибора для счета колоний бактерий или лупы. Для лучшей видимости считают колонии на темном фоне (под чашку кладут темную бумагу), чашки помещают дном вверх. Каждую колонию отмечают на дне чашки чернилами или тушью.

При подсчете придерживаются следующих правил:

а) если на чашке выросло небольшое количество колоний, примерно до 100, подсчитывают все колонии;

б) если колонии распределены равномерно и их количество измеряется несколькими сотнями (200-300 колоний), допускается подсчёт колоний не менее чем на 1/3 площади чашки. В этих случаях дно чайки делят карандашом на 6 секторов и считают колонии в 3 секторах. Затем делают пересчет на всю площадь чашки: вычисляют среднее количество колоний на площади одного сектора и полученное количество колоний на одном секторе умножают на 6;

в) если на чашке вырастает более 300 колоний, они распределены равномерно и не представляется возможным повторить анализ, то, применяя прибор для счета колоний бактерий, подсчитывают 10 полей зрения площадью по 1 см² в разных местах чашки. Полученные числа складывают и выводят среднее арифметическое. Чтобы высчитать количество колоний на всей чашке, полученное среднее число умножают на площадь чашки πR². Обычно диаметр чашки равен 8,5-10 см, π = 3,14. Подставив данные в формулу, получаем при диаметре чашки, равном 10 см, площадь чашки 78,5 см². При отсутствии прибора для счёта колоний бактерий можно использовать обычную миллиметровую бумагу, в которой вырезают «окошко» площадью I см². Подсчёт колоний производят с лупой, как указано выше.

Пример, если среднее число колоний на I см² составляет 18_, диаметр чашки 10 см, то число колоний на всей площади чайки 18 x 78,5 = 1413, округляя в ответе, указывают 1400.

Число колоний, выросших на чашке, должно отражать количество жизнеспособных микроорганизмов, содержащихся в засеянном объеме исследуемого материала. Поскольку последний, как правило, засевают в разведенном виде, число выросших на чашке колоний умножают на степень взятого разведения, рассчитывают среднее арифметическое и устанавливают количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов в I г(мл) продукта.

При установлении количества мезофильных бактерий не все чашки могут быть использованы для вычисления среднего арифметического:

а) нельзя использовать посевы для вычисления среднего арифметического, если количество выросших колоний на чашках менее 30. В этом случае в протокол исследований вносят показатели обсемененности, полученные при подсчёте колоний только по одной или двум чашкам, число колоний на которых больше 30. В случае роста колоний на засеянных чашках в количестве менее 30, в результатах анализа рекомендуется следующая формулировка: «Рост единичных колоний при посеве (указать количество засеянного продукта)».

б) не используются посевы для вычисления среднего арифметического показателя на тех чашках, на поверхности которых более чем на 1/2 площади отмечается ползучий рост спорообразующих микроорганизмов, последние могут маскировать рост прочих бактерий. Возможны случаи, когда на чашках из всех разведений получен рост споровых микроорганизмов, и подсчёт изолированных колоний практически не возможен. В этих случаях в протоколе исследования следует указывать: «Рост спорообразующих микроорганизмов».

Пример расчёта: Если на чашках Петри при посеве 0,1 г продукта выросло в среднем 135 колоний, а при посеве 2-го разведения (0,01г продукта) - 9 колоний, то в результатах исследования учитывают цифровые данные, полученные при посеве 1-го разведения, т.е. количество микроорганизмов 135 х 10 = 1350 в I г продукта.

Для получения более точных данных по количеству мезофильных бактерий, целесообразно сопоставлять результаты подсчета колоний, полученные на чашках с посевами материала из последовательных разведений. Числа подсчитанных колоний должны примерно соответствовать кратности взятых разведений. Если количество колоний на чайках о посевами из последующих разведений (1:10, 1:100) почти совпадает или мало между собой разнится, то это указывает на недостаточное перемешивание посевного материала при приготовлении разведений и перед посевом.

3.4. Метод определения количества и титра бактерий группы кишечных палочек

Для приведения в соответствие показатели "бактерии группы кишечных палочек" с принятой международной номенклатурой (Coliformea - ФАО/В08 и СЭВ), а также с действующими ГОСТ 2874-82 («Вода питьевая») в настоящих "Методических указаниях" к бактериям группы кишечных палочек отнесены грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 36°С±1°С.

При необходимости производится дальнейшее исследование с идентификацией до E.coli.

В тех случаях, когда на продукт имеется норматив - отсутствие бактерий группы кишечных палочек в определенной массе продукта (альтернативный показатель), то результат записывается в соответствии с количеством продукта, подвергнутого микробиологическому анализу, Например, "бактерии группы кишечных палочек в I г — отсутствуют".

В тех случаях, когда продукт должен содержать сравнительно низкие количества БГКП — не выше 10³ - (например, диетические молочные продукты - творог, сметана детская диетическая и т.д.), определение БГКП проводят методом наиболее вероятного числа (НВЧ).

В тех случаях, когда на продукт имеется действующий ГОСТ, предусматривающий норматив по коли-титру, или необходимо выявить значительную степень загрязнения продукта БГКП_е определяют их коли-титр.

3.4.1. Методика посева продуктов при альтернативном определении БГКП

Для посева используется то количество продуктов, в котором в соответствующей НТД предусматривается отсутствие БГКП. При этом продукт жидкой консистенции (напитки, кисели, компоты) засевают непосредственно в среду Кесслер с лактозой (с поплавком) или в среду КОДА, соблюдая соотношение продукта и среды 1:10. Продукты плотной консистенции подготавливают к посеву в соответствии с п. 4.1. Посевы помещают в термостат при температуре 37°С на 24 часа. При отсутствии признаков роста - газообразования или изменения цвета среды дают заключение о соответствии исследованного продукта нормативу (например, БГКП в I г отсутствуют). При наличии признаков роста на среде КОДА дают заключение о несоответствии продукта нормативу на БГКП. При наличии признаков роста в среде Кесслер с лактозoй необходимо для окончательного заключения присутствия в продукте БГКП произвести высев из газ-положительных пробирок на чашки со средой Эндо. Чашки помещают в термостат с температурой 37°С на 18-20 часов. Посевы просматривают. Из колоний, подозрительных или типичных для БГКП, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Обнаружение грамотрицательных палочек указывает на наличие БГКП.

3.4.2. Определение количества бактерий группы кишечных палочек методом наиболее вероятного числа - НВЧ (Coliformes - ФАО/ВОЗ и СЭВ)

Группа колиформных бактерий включает все аэробные и факультативно анаэробные грамотрицательные неспорообразующие палочки, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и газа в течение 24-48 часов при 36°C ±l°C, относящиеся к E.coli, Citrobacter, Enterobacter, Klebella и Seratia. В связи с гем, что в п.4.4.1 настоящих «Методических указаний» принято определять БГКП по ферментации лактозы при 36°С±1°С в течение 24-48 часов, то группы микроорганизмов, относящиеся к "колиформным бактериям" и БГКП, в настоящих "Методических указаниях" максимально сближены и по существу являются идентичными.

Поэтому метод определения НВЧ для колиформных бактерий отражает и определение наиболее вероятного числа БГКП в исследуемом объеме продукта.

Ход исследования

Гомогенат, приготовленный по п.4.1., или жидкий продукт, разведенный 1:10, набирают в пипетку в количестве 1,0 мл и переносят в пробирку, содержащую 9 мл 0,1% пептонной воды или изотонического раствора хлорида натрия, смешивают осторожно, набирая и выдувая из пипетки 10 раз, получая т.о. разведение продукта 1:100. Затем готовят разведения 1:1000, перенося каждый раз стерильной пипеткой I мл из приготовленного разведения в следующую пробирку с 9 мл 0,1% пептонной воды. Осторожно встряхивают все разведения.

Вносят по I мл разведения продукта 1:10 в 3 пробирки с 10 мл среды КОДА. Таким же образом производят посев двух последующих разведений 1:100 и 1:1000, используя для этих целей каждый paз чистую стерильную пипетку.

Посевы инкубируют при 36°C±l°C в течение 24 часов.

Регистрируют все пробирки, показавшие образование газа или изменение цвета среды через 24 часа. Пробирки без признаков роста инкубируют еще 24 часа и затем регистрируют те пробирки, где есть признаки роста. Затем проводят тест, подтверждающий наличие БГКП в исследуемом продукте, для чего переносят одну полную петлю из каждой положительной пробирки со средой КОДА в отдельные пробирки с желчно-лактозным бульоном, содержащим бриллиантовую зелень (п.6.6.) - средой ХЛБ, и инкубируют эти пробирки при 37°С в течение 24-48 часов. По образованию газа в поплавках регистрируют число положительных пробирок, которые подтверждают наличие БГКП.

Расчёт наиболее вероятного числа (НВЧ) БГКП.

Наиболее вероятное число БГКП рассчитывается в зависимости от количества пробирок с положительной пробой на газообразование в ХЛБ по таблице 1. Например, положительное газообразование отпечено в 3-х пробирках посева разведения 1:10, в I пробирке посева разведения 1:100 и 0 пробирок ив разведения 1:1000. Из таблицы видно, что НВЧ для такой комбинации положительных реакций равно 43 бактериям в I г продукта. В заключении указывают: "I г или I мл продукта содержит 43 БГКП".

Определение E.coli по методу НВЧ.

При необходимости определения наличия E.coli в исследуемом на БГКП продукте по методу НВЧ одновременно с подтверждающим пересевом на ХЛБ с бриллиантовой зеленью может быть сделан пересев из всех пробирок с наличием признаков роста на среде КОДА на среду Кесслер с лактозой или на среду для E.coli (п.6.7) - ЕС-бульон. Засеянные пробирки инкубируют при 44⁰С±1°С 24 часа и регистрируют образование газа.

Для дифференциации выделенных культур применяют реакции на индол, метил-рот, Фогэо-Проскауэр и цитрат.

Из пробирок с положительной реакцией (образование газа) штрихом производят посев на чашку с агаром Левина таким образом, чтобы получить изолированные колонии, и инкубируют 18-24 часа при 37°С.

Переносят 2-3 колонии с каждого выросшего посева на среде Левина на чашку или пробирку с 2% МПА и инкубируют 18-24 часа при 37°С. В то же время из каждой культуры готовят мазки и производят окраску по Граму._.

Таблица 1 - Таблица пересчета НВЧ и пределы с 95% вероятности при использовании 3-х пробирок

Постановка тестов ИМАЦ

Тест на индол

Культуру со скошенного агара инокулируют в пробирку с 5 мл индольной среды (п.6.10.) и инкубируют при 37°С в течение 24 часов. Добавляют 1 мл индольного реактива. При наличии индола в пограничном слое в течение 5 мин появляется красное окрашивание - положительная реакция.

Реакция Фогес-Проскауэра (на ацетилметилкарбинол)

Культуру со скошенного агара петлей вносят в пробирку с 5 мл среды Кларка (п.6.12.). Посев инкубируют при 37°С в течение 48 часов. Затем к I мл культуры, перенесенному в другую пробирку, добавляют 0,6 мл этанолнафтольного реактива и 0,2 мл раствора КОН. Встряхивают после добавления каждого реактива, читают реакцию через 15 минут. Учёт результатов возможен и через 2 часа. Окраска от розовой до ярко-красной показывает, что реакция на образование ацетилметилкарбинола положительная.

Тест с метил-рот.

Инокулируют пробирку со средой Кларка и инкубируют в течение 48 часов при 36°С±1°С (параллельно с постановкой реакции на ацетилметилкарбинол), в оставшиеся после постановки реакции Фогеса-Проскауэра 4 мл культуры добавляют 4-5 капель индикатора метил-рот в каждую пробирку. Реакция ферментации углеводов с образованием кислоты положительная, если появилось красное окрашивание.

Тест с утилизацией цитрата.

Культуру с МПА пересевают в пробирку со средой Ковера (цитратной) или на чашку со средой Стимонса, инкубируют 96 часов при 37°С и проверяют рост. Отсутствие роста и изменения цвета среды - реакция отрицательная. Наличие роста, изменение окраски среды с оливково-зеленого цвета на васильковый свидетельствует об утилизации цитрата — реакция положительная.

Таблица 2 - Классификация бактерий группы кишечных палочек по тестам И М А Ц

Используя табл. 2, принимают, что E.coli - это грамотрицательные, неспорообразующие палочки, образующие газ из лактозы и дающие положительную или отрицательною реакции на индол, положительную — с метил-рот и отрицательные реакции Фогеса-Проскауэра и на цитрат - (+ - -) или (- + - -). Количество E.coli в 1 г рассчитывают по таблице 4.4.2.3., учитывая поло положительных пробирок со средой Кесслер с лактозой или ЕС-бульоном, инкубированных при 44^оС. В заключении указывают: «В 1 г(мл) продукта содержится "N" E.coli.

Схема I. Регистрация пробирок с наличием газа и расчёт НВЧ по таблице.

3.4.3 Метод определения коли-титра БГКП

Под коли-титром следует понимать наименьшее количество исследуемой пробы, выраженное в мл (вода, жидкие пищевые продукты) или в г (плотные пищевые продукты), в котором обнаруживается присутствие бактерий группы кишечных палочек.

При определении титра кишечных палочек выявляют их наличие в различных объемах исследуемого продукта.

При наличии стандартных методов подвергают исследованию те количества продукта, которые предусмотрены соответствующими ГОСТ, весь ход исследования, сроки и температура выращивания, а также количественный и качественный учёт кишечных палочек должен соответствовать ГОСТ на тот или иной пищевой продукт.

Методика посева пищевых продуктов, не имеющих ГОСТ*

Первый этап: Первичные посевы на среду накопления.

Засевают 4 или более десятикратно убывающих количеств пищевого продукта, например, 10,0; 1,0; 0,1; 0,01 мл (Г),

В качестве среды накопления применяют среду Кеослер с лактозой или среду КОДА. Среды разливают в пробирки не менее чем по 5 мл для посева малых объемов (I мл, г и менее). Для посева объема от 10 мл и более среду разливает во флаконы по 50-100 мл (применение поплавков не обязательно). Для определения тигра бактерий группы кишечных палочек засевают в среду Кесслер исходную 10%-ную взвесь в количестве 100 мл (10 г продукта) во флакон со 100 мл среды двойной концентрации, 10 мл (I г продукта) - во флакон с 50 мл среды, 1,0 (0,1 г продукта), а также 1 мл из разведения 1:100 (0,01 г продукта) и т.д. - в пробирки с 5,0 мл среды. Посевы выдерживают в термостате при 37°С 16-24 часа.

*)— В тех случаях, когда на исследуемый продукт имеется микробиологический показатель, то засевается соответствующее количество продукта (п.4.4.1.)

Второй этап. Пересев на плотную сроду Эндо.

Из всех пробирок с посевами на среде Кесслер или КОДА независимо от помутнения среды, производят высевы на сектора чашек со средой Эндо (при отсутствия среды Эндо пользуются средой Левина). Для получения изолированных колоний берут петлей минимальное количество материала при значительном помутнении среды Кесслер и производят посев частым штрихом. Чашки с посевами помещают в термостат при 37°С на 16-24 часа.

Чашки с посевами на среде Эндо просматривают. При отсутствии характерных колоний на всех секторах чашки дают ответ— "титр бактерий группы кишечных палочек более 11,1^я. При наличии на среде Эндо колоний, характерных для бактерий группы кишечных палочек - красных с металлическим блеском или без него, розовых с тёмным центром, розовых, слизитых, бледно-розовых, производят их изучение.

Из изолированных колоний, характерных для бактерий группы кишечных палочек, готовят препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. В случае обнаружения в препарате смешанной культуры, выбирают другую колонию и производят рассев на чашку со средой Эндо для получения чистой культуры. При отсутствии в мазках грамотрицательных палочек дают ответ - "титр бактерий группы кишечных палочек выше 11,1*.

Заключение о наличии бактерий группы кишечных палочек только по внешнему виду колоний, без их изучения, недопустимо.

В случае обнаружения в препаратах грамотрицательных палочек исследование продолжают. Из проверенных колоний грамотрицательных палочек производят высевы на среду Гисса с глюкозой, разлитую в пробирки с поплавками. При наличии однотипных колоний грамотрицатедьных палочек на всех 4-х секторах чашки со средой Эндо допускается высев колоний на среду Гисса с глюкозой из двух последних секторов (разведений).

*) - лактозоотрицательные колонии (бесцветные) подвергает дальнейшему изучению для установления их возможной принадлежности к патогенным знтеробактериям, для чего высевают на среду Росселя или Олькеницкого. Последующее изучение производят в соответствии с Инструкцией о порядке расследования, учета и проявления лабораторных исследований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых отравлениях, Москва, 1975 г.

Инкубация при 37°С 18-24 часа. Для ускорения анализа высевы из колоний производят в пробирки с небольшим количеством подогретой до 37°С среды (1,5-2,0 мл). Пробирки с посевами ставят в термостат при 37°С и просматривают через 5-6 часов роста. Наличие кислото- и газообразования в них указывает на присутствие бактерий группы кишечных палочек в том или ином засеянном объеме; пробирки с посевами, не забродившими через 4-6 часов, вновь помещают в термостат при 37°С и выдерживают до 16-24 ч.

Учет результатов

Для установления коли-титра применяют стандартные таблицы. Пользование таблицами возможно только при определенном количестве засеянных объемов. Чаще всего для пищевых продуктов, на которые не имеется ГОСТ, используются таблицы, рассчитанные на посевы 4 десятикратно убывающих количеств от 10,0 г до 0,01 г. Если предполагается более интенсивное обсеменение продукта бактериями группы кишечных палочек, то производят посевы больших разведений от 0,001 до 0,00001 г и для вычисления титра бактерий группы кишечных палочек пользуются таблицами 4.4.3.4.; 4.4.3.5; 4.4.3.6. в зависимости от того, в каком разведении ещё обнаруживается рост кишечных палочек, заканчивая учёт двумя последними разведениями, в которых имеется наличие (в предпоследней) и отсутствие (в последней пробирке) роста бактерий группы кишечных палочек. Например, 0,1+; 0,01+; 0,001+; 0,0001 -. В данном случае следует пользоваться таблицей 4.4.3.5. Для давней комбинации результатов коли-титр равняется 0,0004.

3.5. Метод определения микроорганизмов рода Staphylococcus

Клетки стафилококков сферические, 0,5-1,5 мкм в диаметре. В результате деления более чем в одной плоскости образуют гроздьевидные скопления. Неподвижные, грамположительные. Образуют внеклеточные ферменты и токсины. Температурный оптимум 35-40°С, пределы для роста 6,5 -46°C. Оптимум рН 7,0-7,5, пределы рН для роста - 4,2-9,3. Стафилококки активно образуют пигмент (липохром) золотистый, эмалово-белый, лимонно-желтый, особенно при комнатной температуре (20°С) и при доступе воздуха. Колонии стафилококков на плотных средах имеют форму правильных дисков от 2 до 4 мм в диаметре. Края колонии ровные, поверхность слегка выпуклая, блестящая, непрозрачная, окрашена в цвет пигмента. В жидких средах дают сильное диффузное помутнение, образуя постепенно осадок. Согласно последней классификации (Берги, I980) род Staphylococcus включает три вида: Staph.aureus, St.epidermidis, St.saprophyticus. Стафилококки, относящиеся ко всем трем видам, могут быть причиной различных заболеваний человека, а стафилококки, вырабатывающие энтеротоксины, при определенных условиях могут вызывать пищевые интоксикации. В настоящее время целесообразно использовать в качество санитарно-показательного микроорганизма при исследовании пищевых продуктов, а также при обследовании объектов общественного питании, особенно пищеблоков в детских дошкольных и подростковых учреждениях для оценки их санитарного содержания.

3.5.1. Методика количественного определения Staph.aureus

Методика выделения St.aureus предусматривает его количественное внредоленне в иицевых продуктах и наличие его в смывах.

I этап: Из исходной 10% взвеси продукта производят посев на элективные среды: желточно-солевой (ЖСА) или молочно-солевой (МСА) агары. Основную 10% взвесь в количествах 0,5 и 0,1 мл (0,05 и 0,01 г продукта) наносят на поверхность среды, равномерно распределяют и тщательно растирают шпателем. Кроме этого, I мл исходной взвеси (0,1 г продукта) засевают в пробирки с 5 мл 6,5%-гo солевого бульона. Продукты жидкой консистенции высевают на плотные среды в количестве 0,5 и 0,1 мл, а в жидкие - 1,0 мл. Продукты с пониженной водной активностью (a_w0,86) или с повышенным содержанием поваренной соли дополнительно засевают также в количестве I_fO мл (0,1 г, мл продукта) ва сахарный бульон, рввяктый и пробирки по 5 мл.

Посевы инкубируют при 37^оС в течение 18-24 часов, чашки с плотными средами оставляют ещё на сутки при комнатной температуре*.

2 этап а) Просматривают посевы на МСА или ЖСА, на ЖСА колонии стафилококков дают радужный венчик, на МСА - образуют пигмент: золотистый, кремовый, эмалево-белый и др. Изолированные колонии, подозрительные на стафилококк, изучают, микроскопируют с окраской по Греку и высевают на скошенный МПА или на сектора чашки с молочным агаром. Число колоний, взятых для идентификации, должно быть не менее 5-7.

б) Из сред обогащения производят высевы на сектора чашки с молочным агаром.

Все посевы инкубируют при 37°С в течение 18-24 часов.

3 этап Выделенную чистую культуру с секторов на чашках с молочным или из пробирок со скошенным МПА подвергают микроскопии с окраской по Граму. При наличии мелких грамположительных кокков ставят реакцию плазмокоагуляции.

3.5.2. Постановка реакции плазмокоагуляции.

Наилучшим методом предварительной идентификации St.aureus в лабораторных условиях является коагулазная проба в пробирке, закрытой ватной пробкой, с кроличьей или человеческой плазмой. При чтении реакции плазмокоагуляции установлено 3 градации активности фермента коагулазы:

I) ++++ - сгусток плотный, 2) +++ - сгусток, имеющий небольшой отсек, 3) ++ - сгусток в виде взвешенного мешочка.

Эту реакцию следует читать очень осторожно, чтобы не повредить и не нарушить начало ее образования.

*) - На средах, содержащих желток, стафилококк, выделенный от человека, образует у 60-70% выделенных культур венчик вокруг колоний (положительная лецитовителлазная реакция). Стафилококки животного происхождения дают положительную децитовителлазную реакцию в 5-10% культур.

Постановка реакции В пробирку с 0,5 мл цитратной плазмы, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:4_, вносят петлю суточной культуры стафилококка и ставят в термостат при 37°С. Осторожно просматривают реакцию плазмокоагуляции через 30 минут, I час, 2-4 часа и оставляют до утра при комнатной температуре для окончательного учета. Ускорение реакции производят за счет использования 3-4 часовых бульонных культур, добавляя их в количестве 0,1 мл к 0,5 мл разведенной плазмы.

После полного подтверждения принадлежности выделенных штаммов к St.aureus производят подсчёт колоний на плотной среде и устанавливают содержание стафилококков в I г(мл) исследуемого продукта.

3.5.3. Определение St.aureus в особо скоропортящихся продуктах, имеющих микробиологический норматив*

В ряде продуктов общественного питания микробиологические нормативы предусматривают отсутствие St..aureus в 0,1 г и в 1,0 г продукта.

В тех случаях, когда отсутствие St.aureus предусматривается в 0,1 г продукта, необходимо I мл 10%-й взвеси продукта, приготовленной в соответствии с п.4.2, внести в 9 мл солевого бульона (6,5%). В тех случаях, когда отсутствие St.aureus, предусматривается в I г продукта, для этих целей усредненная проба массой в 10 г pастирается в стерильной ступке и отсюда делается навеска на стерильном часовом стекле или стерильном пергаменте массой 1,0 г и засевается в 9 мл солевого бульона.

Посевы инкубируют при 37^оС в течение 18-24 часов. После чего из солевых бульонов производят подтверждающий посев петлей на сектора чашки Петри с желточно-солевым или молочно-солевым агаром.

*) - «Временные указания по микробиологическим нормативам для ряда особо скоропортящихся пищевых продуктов и методам их исследования»_, М.,1982 г. Утв. МЗ СССР 30/ХII-81 г. № 2510-81.

Инкубацию посевов производят при 37°С в течение 18-24 часов. После чего чашки просматривают. При отсутствии роста типичных колоний для S t.aureus делают заключение об отсутствии этого микроорганизма в исследуемой навеске продукта (в 1,0 г или 0,1 г).

При наличии роста подозрительных на стафилококки колоний производят их изучение, как в п.4.5.1. (этапы 2 и 3), п. 4.5.2.

При наличии коагулазоположительных S t.aureus делают заключение о присутствии этого микроорганизма в исследуемой полоске продукта. Следовательно, данный продукт не соответствует требуемому нормативу — "отсутствие S t.aureus в 1,0 или в 0,1 г продукта".

3.5.4._Дополнительные тесты идентификации __

При наличии санитарно-эпидемического неблагополучия следует использовать дополнительные тесты. Прежде всего еще раз уточнить реакцию плазмокоагуляции, с этой целью культуру пересевают 2-3 раза на скошенной МПА и повторяют постановку реакции, или рассевают культуру на чашках с мясо-пептонным агаром для проведения повторной идентификации на новых колоний стафилококков. В случае неудовлетворительных результатов целесообразно из первичных посевов взять ряд других колоний и подвергнуть их вновь идентификации.

Если выделенную культуру не идентифицировали как S t.aureus, следует использовать дополнительные тесты: постановку реакции на термостабильную ДНКазу, окисление маннита, фосфатазу, лецитовителлазу.

Тест на лецитовителлазу

При использовании для первичного посева среды, содержащей желток, специального дополнительного определения лецитовителлазной активности у стафилококков проводить не следует. В случае выделения культур с других сред и необходимости определения у них этого признака на чашку с желточным агаром сеют испытуемую культуру штрихом или бляшкой - последнее экономнее. Чашки инкубируют при 37°С в течение 18-20 часов. Ори положительном результате вокруг колонии стафилококка образуется радужный венчик, что обусловлено выделением фермента лецитовителлазы и разложением лецитина, находящегося в среде. Реакцию следует учитывать в отраженном свете.

Реакция на разложение маннита в анаэробных условиях

Используют среду, приготовленную из сухого препарата с индикатором ВР и маннитом, разливают в пробирки по 10 мл, стерилизуют при 0,7 атм 20 минут. Перед посевом среду освобождают от воздуха, для чего пробирки кипятят в водяной бане при 100°С 10 минут, затем быстро охлаждают в ледяной воде и немедленно производят посев уколом. Сверху засеянную среду заливают расплавленным 2% водным агаром слоем 2-3 см, чтобы исключить попадание воздуха. Посевы термостатируют при 37°С в течение 4 дней. Просмотр осуществляют на 2 и 4 дни. Результаты расценивают как ферментацию маннита, когда нижняя и верхняя части среды чётко изменяют цвет из зеленого на синий. В этом случае микроорганизмы идентифицируют как S t.aureus. Если посинеет только верхняя часть среды, то имеет место окисление маннита. Если спустя 4 дня инкубации не произошло посинения, сбраживания маннита не произошло. В 2-х последних случаях микроорганизмы относят к S t.epidermidis или S t.saprophyticus.

Определение активности кислой фосфатазы

Среда: к 100 мл 2% МПА, расплавленного и остуженного до 45°C, добавляют 50 мг паранитрофенилфосфата натрия, разливают в чашки Петри. Посев производят бляшками - до 20 бляшек на чашку. Реакцию можно учитывать уже через 2 часа инкубации при 37°С. Вокруг бляшек при положительной фосфатазной пробе среда окрашивается в желтый цвет. Интенсивность окрашивания увеличивается через 18-24 часа - практически окрашивается вся среда.

Тест на наличие термостабильной дезоксирибонуклеазы (ДНКазы)

ДНКаза определяется по методу, основанному на метахроматических свойствах толуидина голубого. Этот метод диффузии в агар термостабильной ДНКазы St.aureus позволяет определить ее в концентрации примерно 0,005 мг/мл.

Среда: к 1000 мл 0,05 М трис-буфера (оксиметиданинометан), рН 9,0, добавляют 0,3 г ДНК, затем 10,0 г агара Дифко, I мл 0,01 М CaCI₂, 10,0 г NaCI, 3,0 мл 0,1 М толуидина голубого. Среду разливают в пробирки по 12-15 мл, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике до 3-5 месяцев. Перед постановкой реакции среду растапливают и разливают в чашки Петри, подсушивают при 4°С в течение I часа, вырезают лунки диаметром 3 мм, отсасывают пипеткой агар и вносят в лунки пастеровской пипеткой культуры, инкубируют при 37°С.

Перед изучением культур пробирки с суточным ростом стафилококков на полужидком агаре прогревают в кипящей водяной бане 15 минут и вносят в лунки в агаровой пластинке, содержащей толундин голубой. Зоны просветления с розовым окрашиванием образуются в результате гидролиза ДНК, находящейся в среде, термостабильной ДНКазой стафилококков. Появление через 1-2 часа после внесения розовоокрашенных зон расценивается как положительная реакция на наличие термостабильной ДНКазы.

3.5.5. Идентификация стафилококков*

*) тесты на окисление маннита, термоустойчивую ДНКазу, кислую фосфатазу проводят в случае отрицательной реакции плазмокоагуляции.

3.6. Метод определения бактерий рода Proteus

Среди этиологических факторов пищевых токсикоинфекций существенную роль могут играть бактерии рода Proteus. Обнаружение небольших количеств протея в исследуемых продуктах не является поводом для подозрения его как возбудителя пищевого отравления. Однако, факт обнаружения протея является сигналом для проведения ряда санитарно-гигиенических и профилактических мероприятий на обследуемых объектах.

К роду Proteus относятся грамотрицательные бескапсульные в основном, подвижные бактерии, разжижающие желатину и расщепляющие мочевину, не образующие ацетилметилкарбинол и дающие положительную реакцию с метил-рот.

На основании различий по некоторым ферментативным свойствам возможна дифференциация рода Proteus на две биогруппы: Proteus vulgaris, который образует индол, ферментирует мальтозу и не декарбоксилирует орнитин, и Proteus mirabilis, который не образует индола, не ферментирует мальтозу и декарбоксилирует орнитин.

Методика выделения бактерий рода Proteus.

I день.

а) для получения чистой культуры первичный посев исследуемого материала из основного разведения (10% взвесь) производят по 0,5 мл в конденсат свежескошенного агара по методу Шукевича.

На 2-й день просматривает посевы на скошенном МПА, если наблюдается вползающий нежный рост вуалеобразный рост, то с верхнего края выросшей культуры готовят препарат, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамотрицательных полиморфных палочек дают заключение о наличии бактерий рода Proteus в исследуемом продукте.

Кроме того, можно использовать посев на поверхность питательной среды Плоскирева или среды Вильсон-Блера, который производят в количествах 0,5 мл исходной взвеси, тщательно втирая шпателем, инкубируют, вырастает 0-форма протея. Для получения из 0-форм колоний Н-форм одну петлю суточной бульонной культуры протея наносят на поверхность свежеприготовленного 1,5% МПА в центре чашки. Через 16-18 часов инкубирования при 37°С наблюдается феномен «роения» - поверхность покрывается тонким слоем валета с голубоватым оттенком.

После инкубации в течение 18-24 часов при 37°С чашки с посевами просматривают и отмечают колонии, подлежащие дальнейшему исследованию. На среде Плоскирева штаммы растут в виде прозрачных колоний, слегка подщелачивая среду, которая окрашивается вокруг них в желтоватый цвет. При более длительном хранении чашек с посевами колонии мутнеют, а центр их приобретает бурую окраску. На висмут-сульфитном агаре (среда Вильсон-Блера) через 48 часов штаммы вырастают в вида изолированных колоний грозно-коричневого цвета, окраска среды под колониями не изменяется.

Если рост 18-24 часовой культуры однородный, то для дальнейшего изучения используют не менее 3-х колоний. При росте разных колоний для их изучения надо брать больше колоний, различных по внешнему виду. При наличии характерной микроскопической картины дают заключение о присутствии бактерий рода в исследуемом продукте.*

Случайные находки бактерий рода Proteus при определении бактерий группы кишечных палочек необходимо отражать в ответе.

*) - Идентификацию бактерий рода Proteus, проводят в случае эпидситуации на объекте в соответствии с Инструкцией о порядке расследования, учета и проведения лабораторных исследований в учреждениях санэпидслужбы при пищевых отравлениях, Москва, 1975 г.

3.7. Определение сальмонелл

В соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ в большинство пищевых продуктов нормируется отсутствие сальмонелл в определенной массе продукта. Сальмонеллы, признаны индикаторными микроорганизмами при контроле пищевых продуктов на возможное присутствие патогенных микроорганизмов. В особо скоропортящейся продукции общественного питания сальмонеллы не допускаются в 25 г. Анализ проводят в соответствия с Инструкцией о порядке расследования, учета и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых отравлениях, Москва, 1975 г.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: