МИКРОСКОПИЯ В ТЕМНОМ ПОЛЕ

Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. Чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура объектива должна быть меньше, чем апертура конденсора. Для уменьшения апертуры в обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диафрагмой.

При темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне. При этом способе микроскопии могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. Однако темнопольная микроскопия позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучить внутреннюю структуру. С помощью темнопольной микроскопии изучают препараты типа раздавленная "капля". Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений.

При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.

При таком освещении лучи не попадают в объектив и остаются невидимыми для глаза, поэтому поле зрения выглядит совершенно черным. Если препарат содержит какие-то частицы, например микроорганизмы, то косые лучи в определенной степени отражаются от их поверхности, отклоняются от своего первоначального направления и попадают в объектив. В этом слу­чае наблюдатель видит на интенсивно черном фоне ослепительно яркие, светящиеся объекты. Такое освещение препарата достигает­ся применением специального темнопольного конденсора, которым заменяют обычный конденсор микроскопа. Основная особенность темнопольных конденсоров заключается в том, что центральная часть у них затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. (Темнопольный конденсор имеет затемненную среднюю часть, поэтому централь­ные лучи света, идущие от зеркала, задерживаются, а в плоскость препарата попадают только боковые лучи, отраженные от зеркаль­ных поверхностей, расположенных внутри конденсора). При микроскопировании в темном поле можно увидеть объек­ты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, т. е. лежит за пределами видимости обычного микроскопа. Однако на­блюдение объектов в темном поле позволяет различать только их контуры, но не дает возможности рассмотреть внутреннее строение.

Микробы при этом начина­ют светиться подобно тому, как невидимые в воздухе мель­чайшие частицы пыли становя­тся видимыми в темном поме­щении при освещении пучком световых лучей, пропущенным через узкую щель.

Конденсор темного поля (рис. 12) состоит из наружного корпуса, в котором расположе­на рамка. К рамке прикре­плен внутренний патрон с оптической частью, состоящей из линзы (кардиоид), за­щитного стекла и кольцевой диафрагмы. Рамка с оп­тической частью перемещается в плоскости, перпенди­кулярной оси, с помощью двух регулировочных винтов. Для получения отчетливого изображения перед нача­лом работы производят центрировку, т. е. совмещение оптической оси микроскопа с осью конденсора. Пра­вильность центрировки узнают по светлому, интенсивно и равномерно освещенному кольцу, видимому в окуля­ре, которое должно быть расположено в центре ноля зрения.

Просмотр препарата с конденсором темного поля производится с сухими и иммерсионными системами объективов. Иммерсионное масло без пузырьков возду­ха наносят между верхней поверхностью конденсора и предметным стеклом; если объектив иммерсионный, мас­ло наносят на покровное стекло. При работе с иммерсионным объективом 90 применяют специальную диаф­рагму, которая прилагается к конденсору темного поля. Толщина предметных стекол не должна превышать 0,8—1,2 мм, покровных—0,2 мм. Стекла должны быть безукоризненно чистыми и прозрачными, без царапин.

Работу проводят при прямом солнечном или электри­ческом освещении. В последнем случае используется специальная осветительная установка с лампой в 100— 150 Вт.

Техника микроскопии. Устанавливают и центрируют освещение по светлому полю. Заменяют конденсор со светлым полем на темнопольный конденсор. Для той же цели можно переделать обыч­ный конденсор. Для этого необходимо отвинтить верхнюю линзу конденсора, положить на центральную часть нижней линзы кружок из черной бумаги (закрыть примерно ²/з линзы), привинтить верхнюю линзу. Ставят конденсор в держа­тель и закрепляют вин­том. Открывают полно­стью диафрагму освети­теля, обеспечивая макси­мальную силу света вы­ключением реостата. На верхнюю линзу приспу­ щенного конденсора на­носят каплю иммерсион­ной жидкости (кедровое масло, смесь вазелиново­го масла и бромнафтали-на, дистиллированной во­ды, что проще и доступ­нее). Жидкость не долж­на содержать пузырьков воздуха. Для исследования в темном поле препарат готовят по методу раздав­ленной капли. Небольшую каплю исследуемого матери­ала наносят на предметное стекло. Каплю накрывают тонким (не более 0,17 мм) покровным стеклом так, что­бы под ним не оказалось пузырьков воздуха. Толщина предметного стекла должна быть не более 1,1 мм, так как в противном случае фокус конденсора (точка пере­сечения высокоапертурных лучей) будет находиться в толще стекла, а не в плоскости препарата и иссле­дователь не получит эффекта темного поля.

Помещают препарат на предметный столик микро­скопа. Приподнимают конденсор до тех пор, пока иммерсионная жидкость распространится по нижней поверхности предметного стекла. Револьвером устанав­ливают малое увеличение и фокусируют микроскоп на препарат. При правильной центрировке конденсора к оптической оси объектива в поле зрения должно быть светлое пятно или светлое пятно с темным центром и светящиеся подвижные точки бактерий или других частичек, содержащихся в препарате. Регулировочным винтом конденсора центрируют светлое пятно на сере­дину поля зрения, а интенсивность его видимости регу­лируют подъемом или опусканием конденсора. После этого револьвером устанавливают объектив с нужным увеличением (обычно Х40), дополнительно центрируют конденсор и зеркало.

Микроскопия в темном поле зрения применяется для наблюдения за подвижностью микробов, обнаружения возбудителей некоторых болезней (лептоспир) и изу­чения таких микробов, величина которых находится на грани разрешающей способности светлопольной микро­скопии. В темном поле зрения можно изучить влияние различных воздействий на клетку, наблюдать за изме­нением степени дисперсности коллоидов протопласта и их коагуляцией. В неповрежденной живой клетке протоплазма бывает гомогенной. В результате гибели или повреждения клетки ее содержимое начинает ярко светиться. Однако в темном поле зрения нельзя хорошо изучить форму и тем более внутреннее строение микро­бов.

Порядок работы с темнопольным конденсором

1. Препарат «раздавленная капля», приготовленный на тонком и тщательно очищенном предметном стекле, помещают на столик микроскопа и фокусируют с объективом 8Х. После этого поло­жение тубуса не меняют до фокусировки препарата с объективом 40Х.

2. Вынимают светлопольный конденсор, окуляр и вывинчива­ют один из объективов. Если револьвер микроскопа имеет одно свободное от объектива отверстие, закрытое специальной заглуш­кой, можно воспользоваться этим отверстием, вывинтив заглушку. Устанавливают свободное от объектива отверстие над препаратом.

3. Закрыв диафрагму осветителя почти до предела, фокуси­руют изображение нити лампы на зеркале, прикрытом кружком белой бумаги (как при установке света по Кёлеру). Уменьшают яркость света с помощью реостата.

4. Открывают диафрагму осветителя. Прикрыв верхний конецтубуса микроскопа матовым стеклом и слегка поворачивая зерка­ло, добиваются равномерного освещения поля. После этого зеркало перемещать нельзя!

5. Вставляют окуляр, устанавливают объектив 8Х и осторож­но, не задевая зеркала,устанавливают темнопольный конденсор.

6. Последний вставляют так, чтобы белый винт был обращен в сторону штатива микроскопа, а два регулировочных винта — в сторону осветителя. Надевают на регулировочные винты ключи. Если при установке темнопольного конденсора произошло хотя бы не­большое изменение положения зеркала, вынимают конденсор и вновь регулируют освещение.

7. Препарат сдвигают в сторону, на верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло и, несколько опустив конденсор,
снова устанавливают препарат, закрепив его клеммами.

8. Поднимают конденсор вверх до упора. Масло должно равномерно заполнить пространство между линзой конденсора ипредметным стеклом и не содержать пузырьков воздуха. В противном случае операцию следует повторить, увеличив масляную
каплю.

9. Отключают реостат осветителя, т. е. получают максимальное освещение.

10. Глядя в окуляр, центрируют конденсор. Для этого с помощью регулировочных винтов приводят точно в центр поля зрения изображение светлого кольца с темным пятном в середине или только светлого пятна. Кольцо или пятно отличаются от ярких,
четко очерченных пузырьков воздуха белесоватым оттенком и «размытостью» — отсутствием четких границ.

11. Если при центрировке обнаружено светлое кольцо, то, наблюдая в окуляр и слегка поднимая или опуская конденсор, уста­навливают последний в таком положении, чтобы в поле зрения исчезло темное пятно и вместо кольца осталось только замкнутое
светлое пятно. Если при центрировке выявлено светлое пятно, конденсор не перемещают.

12. Ставят объектив 40Х и фокусируют препарат.

Для получения лучшего эффекта применяют зеленый фильтр. При смене препарата или объектива тщатель­но проверяют центрировку кольцевой диафрагмы с фа­зовой пластинки. Фазово-контрастный конденсор мож­но оставлять на штативе, так как для перехода к на­блюдению в светлом поле нужно лишь перевести ре­вольвер конденсора в нулевое положение.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: