ТОР 5 статей: Методические подходы к анализу финансового состояния предприятия Проблема периодизации русской литературы ХХ века. Краткая характеристика второй половины ХХ века Характеристика шлифовальных кругов и ее маркировка Служебные части речи. Предлог. Союз. Частицы КАТЕГОРИИ:
|
Фазово-контрастная микроскопия
Фазово-контрастная микроскопия позволяет получать контрастные изображения неокрашенных, неконтрастных объектов, в которых темные и светлые места соответствуют различной толщине и оптической плотности препарата. Известно, что контрастность изображения находится в прямой зависимости от степени поглощения света различными структурными элементами объекта. Если в объекте чередуются места, сильно и слабо адсорбирующие свет, то последний, проходя через объект, изменяет свою амплитуду. Интенсивность световых лучей, прошедших через различные участки такого объекта, будет различной. Такие препараты называются амплитудными. Наряду с амплитудными существуют совершенно прозрачные объекты. Пройдя через такие объекты, свет или совсем не ослабляется, или ослабляется чрезвычайно мало. Однако в зависимости от различных показателей преломления отдельными участками объекта или его неравномерной толщины по выходе из объекта смещается фаза светового колебания. Сдвиг фазы происходит из-за неодинаковой скорости распространения света в средах с различной оптической плотностью. В местах большей оптической плотности свет как бы замедляет свою скорость, изменяется по фазе. Такие объекты называются фазовыми. К ним относится большинство живых клеток и микроорганизмов. Глаз человека и фотопластинка фазовые колебания света не выявляют. Для их обнаружения служит метод фазовых контрастов, предложенный в 1934 г. голландцем Цернике. Метод фазовых контрастов основан на использовании теории Аббе о дифракционном построении изображения в микроскопе/ Сущность метода сводится к тому, что обычный конденсор микроскопа заменяют на специальный конденсор с кольцевой диафрагмой, а в револьвер ввинчивают специальный объектив. На полевую линзу этого объектива нанесена фазовая пластинка в виде кольца, состоящая из тонкого слоя специального состава. Кольцо света, проходя через кольцевую диафрагму конденсора и объект, фокусируется на фазовой пластинке объектива. Фазовая пластинка значительно ослабляет силу света нулевого максимума и смещает фазы проходящих через него прямых световых волн на 90°. Луч света, падающий на прозрачный объект, расщепляется на два луча — прямой и дифрагированный. Прямой луч (рис., А) идет из кольцевой диафрагмы, проходит через частицу объекта и фокусируется на кольце фазовой пластинки. Дифрагированный луч, (рис., Б), проходя через объект, не попадает на фазовую пластинку. Оптические пути этих двух лучей оказываются различными. Между ними создается разность фаз, и невооруженным глазом нельзя уловить это смещение фаз. Однако фазовой пластинкой эти фазовые изменения преобразуются в амплитудные, воспринимаемые глазом изменения. Прозрачные в светлом поле зрения препараты становятся резко контрастными на светлом фоне (положительный фазовый контраст) или блестящими на темном фоне (отрицательный фазовый контраст).
Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из: 1) набора объективов-ахроматов. В каждом объективе имеется фазовая пластинка в виде темного кольца, нанесенного на внутреннюю линзу. Назначение пластинки состоит в изменении фазы нулевого максимума на 90° и уменьшении его интенсивности; 2) фазово-контрастного конденсора и револьвера с набором кольцевых диафрагм, которые устанавливают применительно к каждому объективу. Для наблюдения обычным способом в конденсоре имеется ирис-диафрагма, а в диске револьвера — отверстие для пропуска световых лучей. Смена кольцевых диафрагм перед объективом производится поворотом револьвера до фиксации. Для центрировки кольцевой диафрагмы относительно фазовой пластинки объектива служат два боковых винта; 3) вспомогательного микроскопа, вставляемого в тубус вместо окуляра и служащего для наблюдения при центрировке кольцевой диафрагмы по отношению к фазовой пластинке.
Настройку микроскопа с фазово-контрастной приставкой производят следующим образом: 1. Заменяют объективы и обычный конденсор в микроскопе на фазовые. 2. 2. Поворотом диска конденсора устанавливают нулевую диафрагму (в окошечке должна появиться цифра 0). 3. Помещают препарат на столик микроскопа, при объективе ХЮ устанавливают освещение и производят фокусировку. Диафрагму конденсора открывают полностью. 4. Заменяют нулевую диафрагму конденсора на диафрагму, соответствующую увеличению используемого фазового объектива. Так, при рассматривании препарата с объективом ХЮ повернуть револьвер конденсора до появления в окошечке цифры 10. 5. Заменяют окуляр микроскопа на вспомогательный микроскоп. Ослабив винт, осторожно поднимают выдвижную трубу вспомогательного микроскопа до появления отчетливого изображения кольцевой диафрагмы конденсора и фазовой пластинки объектива. 6. Фиксируют выдвижную трубу вспомогательного микроскопа винтом. 7. Вращением центрировочных винтов конденсора совмещают кольцевую диафрагму конденсора с фазовым кольцом объектива. 8. Вынимают вспомогательный микроскоп из тубуса, вставляют нужный окуляр, устанавливают фокус и изучают объект. При каждой смене объективов необходимо повторить все операции, указанные в пунктах 4, 5, 6, 7, 8. Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности оптической системы микроскопа. Однако она позволяет видеть тонкие детали структуры живых микробов, изучить стадии их развития и процесс деления, выявить влияние химических веществ, антибиотиков и других факторов на микробную клетку, измерить ее прижизненную величину. Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст). ДИК (дифференциально-интерференционный контраст) - является прекрасным механизмом для создания контраста в прозрачных препаратах. Микроскопия с ДИК представляет собой интерференционную систему с расщеплением пучка света, при которой контрольный пучок отклоняется на небольшое расстояние, обычно меньшее, чем диаметр дифракционного кружка. С помощью данного метода получается монохроматическое оттененное изображение, которое отображает градиент оптических путей как высоко-, так и низкопространственных частот, присутствующих в препарате. Те участки препарата, при прохождении через которые оптические пути удлиняются по отношению к контрольному пучку, выглядят ярче или темнее, тогда как участки, между которыми различия меньше, обладают противоположным контрастом. Чем круче становится градиент оптических пучков, тем резче контраст изображения. Хоффмановский контраст (ХК) представляет собой метод косого освещения, повышающий контраст в окрашенных и неокрашенных препаратах за счет образования градиента оптических фаз. ХК пoзвoляeт нaблюдaть тpexмepнoe изoбpaжeниe живыx oбpaзцoв в плacтикoвыx чaшкax c выcoкoй чeткocтью. За счет использования бoльшиих paбoчих paccтoяний и выcoких чиcлoвых aпepтуp метод позволяет тoчнo oтcлeживaть движeние в пoлe зpeния, нaпpимep, пpи проведении микроманипуляций. ХК мoжeт быть пpимeнeн нa микpocкoпe c флуopecцeнтным ocвeтитeлeм. Изучeниe мopфoлoгии c пpимeнeниeм флуopecцeнции или бeз тaкoвoй вoзмoжнo бeз cмeны oбъeктивoв и oбpaзцa. Стоит отметить преимущество Хоффмановского контраста по сравнению с Фазовым контрастом. Известно, что Фaзoвoму кoнтpacту пpиcущ эффeкт Гaлo - появление светящегося ореола по контуру изображения объекта. B peзультaтe Bы мoжeтe пoтepять вaжную инфopмaцию. XК нe дaeт Гaлo, чтo пoзвoляeт лeгкo oпpeдeлять cвoйcтвa кpaeвыx cтpуктуp, нaпpимep, тoчнo зaмepять углы или расстояния.
Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:
|