ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Люминесцентная микроскопия основана на способности многих веществ биологического происхождения и красителей светиться под воздействием падающего на них света. Молекулы веществ, способных к люминесценции, поглощают энергию падающего све­та и переходят в возбужденное состояние, которое характеризует­ся более высоким энергетическим уровнем. Однако в таком состоя­нии они находятся непродолжительное время и вновь возвращают­ся к исходному энергетическому уровню. Этот переход сопровож­дается отдачей избытка энергии в виде света — люминесценцией. Как правило, для возбуждения люминесценции объект освещают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 300—400 нм или сине-фиолетовыми лучами с длиной волны 400—460 нм, так как в этом случае свет люминесценции лежит в видимой части спектра. Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса). При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.

При работе с видимыми синими лучами можно пользоваться микроскопами с обычной оп­тикой. Дополнительно в комплекте микроскопа должны быть два светофильтра: сине-фиолетовый и желтый,— и специальная лампа для микроскопирования с фокуси­рующей линзой.

Особое внимание обращают на светофильтры, так как сложенные вместе они не должны пропускать ви­димого света. При этом учитывают, что большинство синих и сине-фиолетовых стекол пропускает красные лучи, мешающие при наблюдении. Стеклянный свето­фильтр можно заменить жидким, который готовится следующим образом. К насыщенному раствору медного купороса добавляют 25%-ный раствор аммиака до тех пор, пока не растворится выпавший осадок гидрата оки­си меди. Полученный раствор наливают в плоскую, уз­кую кювету и разбавляют дистиллированной водой до момента появления в поле зрения первых следов света. Если при разбавлении снова выпадает осадок гидрата окиси меди, его растворяют добавлением раствора амми­ака

Ряд веществ биологического происхождения — например, антибиотики и другие соедине­ния обладают собственной (первичной) люминесценцией. В зави­симости от содержания таких веществ в клетке некоторым микро­организмам, например зеленым и сине-зеленым водорослям, неко­торым дрожжам, актиномицетам и бактериям, также свойственна первичная люминесценция. Клетки большинства микроорганизмов люминесцируют очень слабо, поэтому их обрабатывают специаль­ными красителями — флуорохромами, обладающими люминес­ценцией. Люминесценцию объекта после обработки флуорохрома­ми называют наведенной, или вторичной. Для возбуждения вто­ричной люминесценции достаточно использовать сине-фиолетовую часть спектра.

К флуорохромам относятся примулин, акридин оранжевый, берберин-сульфат, аурофосфин и другие красители. Флуорохромы применяют в виде сильно разбавленных водных растворов (1: 500—1: 100 000). Такие растворы мало токсичны, что дает воз­можность изучать живую неповрежденную клетку. Флуорохромы могут окрашивать не только всю микробную клетку, но и избира­тельно концентрироваться на определенных клеточных структурах, вызывая их свечение. В зависимости от химического состава кле­точные структуры в различной степени адсорбируют флуорохром и поэтому люминесцируют разным светом. Флуорохромы неодина­ково адсорбируются живыми и мертвыми клетками.

Например, нейтральный крас­ный (нейтральрот) окрашивает цитоплазму в зеленова­то-желтый, метахрометиновые зерна в темно-красный и вакуоли в ярко-желтый цвет. Акридин (оражневый) ок­рашивает цитоплазму в зеленый, метахроматиновые зерна в ярко-красный, вакуоли в розовый, а ядро в светло-зеленый цвет.

При использовании акридинового желтого или аура-мина можно дифференцировать туберкулезную палочку. Флюорохромированные колонии кишечной палочки мо­гут быть дифференцированы через 6 ч после посева ис­следуемого материала. Благодаря слабой концентрации (0,001—0,00001%) и малой токсичности эти краски мо­гут применяться при изучении структуры живых бакте­риальных клеток. Поэтому люминесцентная микроско­пия широко используется при цитологических исследо­ваниях бактериальной клетки.

Люминесцентная микроскопия увеличивает контрастность изображения, дает возможность различить отдельные клеточные структуры и даже отметить их изменения при различных функцио­нальных состояниях клетки. Люминесцентная микроскопия широко применяется для выявления живых и мертвых клеток, для изучения микроорганизмов в почве, илах и ризосфере растений.

Микроскопия в ультрафиолетовых лучах не имеет большого распространения, так как требует применения дорогостоящей кварцевой оптики. Кроме того, под действием ультрафиолетовых лучей происходит повреждение живых клеток микроорганизмов. Наибольшее значение в настоящее время имеет микроскопия в ко­ротковолновой части видимого света.

Люминесценцию в сине-фиолетовых лучах видимого света можно наблюдать с помощью обычного микроскопа, установив на пути лучей синий стеклянный или жидкий светофильтр, пропус­кающий сине-фиолетовые лучи видимого спектра. Синие лучи, ме­шающие выявлению люминесценции, убирают желтым светофиль­тром, который помещают на окуляр микроскопа. В результате наблюдатель видит на черном фоне люминесцирующие объекты. Од­нако для микробиологических исследований наиболее удобен лю­минесцентный микроскоп МЛ-2 (из отечественных).

Устройство микроскопа МЛ-2

В микроскопе МЛ-2 люминесценция возбуждается сине-фио­летовыми лучами и ближним ультрафиолетом. Оптическая схема микроскопа МЛ-2 позволяет наблюдать объекты при освещении их как в проходящем, так и падающем свете. Чаще свет, возбуждаю­щий люминесценцию, направляется на препарат сверху, через объектив. Общий вид микроскопа показан на рис.19.

Источник света в микроскопе МЛ-2 — ртутная лампа (25), ко­торая вместе с осветительным аппаратом вмонтирована в основа­ние микроскопа (1). Она дает интенсивное излучение в сине-фио­летовой и в ближней ультрафиолетовой частях спектра до длины волны 340 нм. На задней плоскости корпуса осветителя сверху и справа находятся винты (12), служащие для центрирования лам­пы, а на передней плоскости, слева у основания — рукоятка, кото­рой закрывают шторку для защиты препаратов от действия воз­буждающего света во время перерывов в работе. Фокусировку изо­бражения источника света осуществляют перемещением коллек­торной линзы (19) с помощью рукоятки (/5). При освещении объ­екта падающим светом рукоятку (25), расположенную на корпусе основания микроскопа, выдвигают до упора.

Тубусодержатель связан с основанием микроскопа неподвижно. Фокусировка препарата осуществляется вертикальным перемеще­нием предметного столика с помощью макро- (17) и микрометри­ческого (18) винтов. В тубусодержателе имеется специальное гнез­до (/5), в которое устанавливают светофильтры (11) для выделе­ния из общего излучения источника света лучей, возбуждающих люхминесценцию, и диск (8) со светофильтрами, которые поглоща­ют лучи, мешающие выявлению люминесценции. Для возбуждения люминесценции сине-фиолетовыми лучами (максимум пропуска­ния при λ—400 нм) применяют светофильтры ФС-1 толщиной 2 и 4 мм и СС-15 толщиной 2 мм. Так как все фильтры, служащие для возбуждения люминесценции, пропускают красные и инфракрас­ные лучи, их рекомендуется использовать совместно со светофильтрами СЗС-14 и СЗС-7. Для предохранения светофильтров от тепловых лучей рядом с линзой-коллектором устанавливают кювету (29) с дистиллированной водой или раствором медного купороса. В качестве поглощающих обычно используют два склеенных светофильтра из стекол ЖС-19 и ЖЗС-18. Им соответствуют на диске цифры 1 и 2. На вертикальной части тубусодержателя расположены руко­ятки (6) для изменения диаметров апертурной и полевой диафрагм в отраженном свете. Левой рукояткой открывают и закрывают апертурную диафрагму, а правой — полевую. На тубусодержателе укрепляется револьвер (10) с объективами и бинокулярная насадка (23).Бинокулярную насадку АУ-26 закрепляют специальным вин­том (21). Она имеет сменные увеличения 2,5 X, 1,6Х и 1,1 X. Требуемое увеличение устанавливают вращением диска, вмонтирован­ного в основание насадки. На диске кроме цифр, указывающих увеличение, есть обозначение «ФК», которому соответствует линза, используемая для настройки микроскопа.

В качестве монокуляра используют насадку МФН-10 с окуля­рами 8х или 10х. Монокуляр применяется в основном при микро­фотографировании. Для наблюдений удобнее использовать бинокуляр.

Микроскопирование

Готовят препарат и 2—3 раза промывают водопроводной водой. Затем фиксируют его на пламени спиртовки или метиловым спиртом, красят, опуская на несколько ми­нут в слабый раствор флюоресцирующего красителя, приготовленного на стерильной водопроводной воде. За­тем препарат помещают на предметный столик микро­скопа и освещают синими лучами. Для этого между зеркальцем микроскопа и источником света помещают синий светофильтр, пропускающий только лучи, возбуж­дающие флюоресценцию. Необходимо помнить, что в микроскопе МЛ-2 фокусировка препа­рата достигается вертикальным перемещением предметного столи­ка, а не тубуса, как в светлопольном микроскопе. На окуляр микроскопа поме­щают желтый светофильтр, пропускающий все цвета, кроме проходящих через первый светофильтр. При этом условии флюоресценция препарата видна отчетливо. Для увеличения изображения флюоресцирующих объек­тов используют люминесцентный микроскоп, который состоит из трех основных агрегатов: микроскопа, осве­тительного устройства и источника света. Осве­тительное устройство состоит из кварцевого коллектора, полевой диафрагмы и камеры со светофильтрами. Светофильтры служат для выделения ультрафиолетовых лучей из светового потока, поступающего из того или иного источника света. Источником света для получения ультрафиолетовой радиации могут служить ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления

Большинство микробиологических объектов рассматривают с объективами 40х, 70х или 90х. При переходе от объектива мень­шего увеличения к объективу большего увеличения соблюдают определенную последовательность. Просмотрев объект с меньшим увеличением, ставят объектив большего увеличения. Затем фокусиру­ют препарат и вновь настраивают освещение, проверяя центричность и резкость изображения полевой диафрагмы и источника света. С иммерсионными объективами 70х и 90х используют со­ответственно дистиллированную воду и нелюминесцирующее им­мерсионное масло.

Во время перерывов в работе следует включать предохрани­тельную шторку для защиты препаратов от действия света. Нель­зя вынимать кювету с водой при включенной лампе и открытой шторке.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: