ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ РАБОТЫ В УЧЕБНОЙ ЛАБОРАТОРИИ

2.ПРАВИЛА РАБОТЫ С КУЛЬТУРАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Материалы и оборудование: бактериологическая петля, предметные и покровные стекла, пробирки, ватные пробки, спиртовка или газовая горелка.

. Рис.1. Схема приготовления мазка

спиртовки.

Ход работы: Все работы с микроорганизмами необходимо проводить у пламени. С питательной среды микроорганизмы берутся микробиологической петлей, которая предварительно обжигается (фламбируется) в пламени спиртовки.

Порядок работы:

1. зажечь спиртовку или горелку
2. взять пробирку с культурой и поместить ее так, чтобы она находилась между большим и указательным пальцами левой руки, поддерживалась средним пальцем и находилась в наклонном положении
3. взять правой рукой микробиологическую петлю, прокалить ее в пламени спиртовки, держа вертикально
4. правой рукой плотно зажав ватную пробку между мизинцем и ладонью, вращательным движением повернуть пробку, вынуть ее из пробирки и держать концом вниз, чтобы не касалась окружающих предметов
5. обжечь края пробирки
6. ввести остывшую петлю в пробирку и взять небольшое количество микробной массы, слегка прикасаясь к культуре и не царапая плотной питательной среды петлей. Если микроорганизмы выращены в жидкой среде, то берется петлей капля жидкости
7. снова обжечь края пробирки и часть ватной пробки и закрыть пробирку пробкой
8. взятый материал эмульгируют с имеющейся на предметном стекле капле воды и равномерно тонким слоем распределяют по поверхности
9. снова обжечь петлю в пламени, чтобы уничтожить оставшихся в ней микроорганизмов

Окрашенные препараты бактерий готовят в следующей последова­тельности. Приготовление мазка: на чистое и обезжиренное предметное стекло наносят культуру исследуемого микроорганизма, тща­тельно размешивают и распределяют полученную суспензию по по­верхности стекла. Высушивание мазка проводят при комнатной температуре.

Фиксация мазка. Цель фиксации – закрепить препарат на стекле, чтобы при окраске он не смывался, убить микробов для безопасности последующего исследования. Кроме того, мертвые клетки красятся лучше, чем живые, т.к. проницаемость их клеточной стенки увеличивается, поэтому необходимо повы­сить восприимчивость клеток к красителям.

Выделяют физические и химические методы фиксации. Чаще всего осуществляется физический м-д – нагревание (термический м-д или фламбирование), т. е. над пламенем горелки. Хотя данный метод фиксации и является достаточно грубым, но сохраняет морфологию и отношение бактерий к красителям. Препарат проносят 2-4 раза над пламенем спиртовки мазком вверх (стекло должно нагреться до такой степени, чтобы при прикосновении к тыльной стороне ладони вызывало легкое жжение).

Для более детального изучения структуры клеток используют фик­сирующие растворы, предотвращающие ферментативный автолиз бактерий и стабилизирующие макромолекулы путем химического их сшивания. Наиболее часто применяют формалин, спирты, жидкость Карнуа, ацетон и др. Мазки фиксируют, помещая в раствор фиксатора или нанося на мазок.

Для изучения строения бактериальной клетки фиксацию проводят химическими веществами, время воздействия которых различно. Этиловым спиртом (96%) – в течение 10-15 мин., метиловым или амиловым спиртом – 3-5 мин., жидкостью Никифорова (смесь этилового спирта и эфира поровну) – 10-15 мин., ацетоном – 5 мин., хлороформом – несколько секунд, жидкостью Карнуа (96%-ного спирта – 60 мл, хлороформа – 30 мл, ледяной уксусной кислоты – 10 мл) – в течение 10 мин.

Способность клеток воспринимать различные красители отражает их тинкториальные свойства. Это определяется структурой и соста­вом клеточной стенки.

Высушенные и зафиксированные препараты окрашивают, используя простой (для изучения формы микробов) или сложный способ окраски. Чаще всего используют фуксин Циля (несколько капель наливают пипеткой на фиксированный препарат-мазок и в зависимости от толщины мазка выдерживают карболовый фуксин 10-30 сек.) или метиленовую синь Леффлера (выдерживают 3-5 мин.)

Окрашивание препаратов проводится с помощью красителей, ко­торые можно разделить на:

• позитивные (метиленовый синий, фуксин) и негативные (ниг­розин).

Позитивными называются красители, окрашивающие микро­организмы и другие находящиеся на стекле фиксированные объекты,

Негативными - красители, заполняющие пространство, окружающее микроорганизмы, в результате чего последние становятся видимыми в виде силуэтов на фоне красителя;

• кислые (эозин, конго красный) и щелочные (гематоксилин, толуидиновый синий, азур).

Кислые красители связываются с вещества­ми, имеющими щелочную реакцию (например, цитоплазматическими белками),

Щелочные - связываются с базофильными (кислыми) ком­понентами клеток (нуклеиновыми кислотами, рибосомами).

Основные цвета окрашивания могут быть следующими:

красный (основной фуксин, кислый фуксин, сафранин, конго красный);

фиоле­товый (генциановый фиолетовый, метиловый фиолетовый, кристал­лический фиолетовый);

синий (метиленовый синий, толуидиновый синий, водный синий);

зеленый (малахитовый зеленый, бриллианто­вый зеленый).

Для изучения формы микробной клетки и некоторых ее структур препарат (мазок) из материала, со­держащего исследуемый вид микроба, окрашивают.

Большинство микробов быстро и хорошо окраши­вается растворами анилиновых красок, некото­рые виды бактерий плохо или совсем не окрашиваются этими красками. Для окраски таких видов, требуется протравливание веществами, разрыхляющими оболочку клетки. Протравливание осуществляют перед окраской препарата или в момент приготовления растворов кра­сок.

При работе с трудноокрашиваемыми микробам» препарат иногда в процессе окрашивания подогревают над пламенем горелки.

Наиболее часто употребляемые краски. Фуксин основной— солянокислая соль розанилина, блестя­щие зеленые кристаллы, хорошо растворимые в этило­вом спирте и плохо в воде; цвет раствора ярко-красный.

Сафранин — буровато-красный кристаллический порошок, хорошо растворимый в спирте, плохо—в воде; цвет раствора красный.

Нейтральрот (нейтральный красный)—зелено­вато-черный порошок, хорошо растворимый в спирте и воде; цвет водного раствора красный, спиртового— касный со слабым буроватым оттенком.

Метиленовый синий — мелкие зеленые с ме­таллическим блеском кристаллы, хорошо растворимые в спирте и воде; цвет раствора синий.

Кристаллвиолет— зеленые кристаллы, раство­римые в воде и спирте; цвет раствора фиолетовый.

Метилвиолет — краска с большим количеством метильных групп. Выпускается под различными обозна­чениями (4В, 5В, 6В). В бактериологической практике обычно применяется метилвиолет 5В или 6В — темно-синие кристаллы, хорошо растворимые в воде и спирте; цвет раствора фиолетовый.

Генцианвиолет— смесь кристаллвиолета и метилвиолета, хорошо растворимая в спирте и плохо в воде; цвет раствора фиолетовый.

Малахитовая и бриллиантовая зелень — блестящие ярко-зеленые или желтовато-зеленые крис­таллы, хорошо растворимые в воде и спирте; раствор интенсивно желтого цвета.

Фуксин кислый—зеленоватый или буровато-зеленый порошок, хорошо растворимый в воде и труднее в спирте; цвет раствора красный.

Пикрин кислый — блестящие бледно-желтые кристаллы, хорошо растворимые в спирте, эфире и кипя­щей воде; цвет растворов интенсивно желтый.

Приготовление рабочих растворов красок. Прежде чем приготовить рабочие растворы красок, часто забла­говременно из сухих красок готовят насыщенные спир­товые растворы. Для этого краску заливают 96-градус­ным спиртом в соотношении 1:10. При таком соотношении спирт насыщается краской (нерастворенная часть красок выпадает в осадок). С целью экономии рекомендуется брать на 100 мл спирта метиленового синего 7,0, генцианвиолета 4,8, основного фуксина 8,1 г.

Для лучшего насыщения спиртовые растворы поме­щают в термостат и выдерживают до полного растворе­ния красок. Из насыщенных спиртовых растворов по мере надобности готовят водные рабочие растворы.

Карболовый фуксин (Циля). Для приготов­ления берут 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 100 мл 5%-ного водного раствора фенола. Второй раствор при постоянном взбалтывании постепенно приливают к первому, а не наоборот. После смешивания готовый раствор фильтруют через бумаж­ный фильтр и хранят в тщательно укупоренной бутыли из темного стекла.

Карболовый фуксин Циля можно приготовить и по следующему рецепту: 1 г основного кристаллического фуксина, 5 г кристаллического фенола, несколько капель глицерина, 10 мл 96-градусного спирта, 100 мл дистиллированной воды.

Сначала фуксин и карболовую кислоту тщательно растирают в ступке, добавляя по каплям глицерин. За­тем при постоянном помешивании по каплям добавляют спирт, постепенно увеличивая порции, а после этого, на­чиная с малых порций, добавляют воду. Приготовленный в ступке раствор выдерживают 48 ч в термостате при 37° С для полного растворения фуксина, после чего фильтруют через бумажный фильтр. Краска очень стой­кая и может храниться продолжительное время; упо­требляется при работе с трудноокрашиваемыми микро­организмами (споровыми формами, кислотоустойчивы­ми бактериями).

Фуксин Прейффера. Готовят из карболового фуксина Циля путем разбавления дистиллированной во­дой в отношении 1:10. Раствор очень нестоек и при хра­нении обесцвечивается, поэтому такие растворы гото­вят перед употреблением в небольшом количестве.

Метиленовый синий (раствор Лёффлера). Щелочной спиртово-водный раствор краски. К 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего добавляют 100 мл дистиллированной воды и 1 мл 1 % -ного водного раствора едкого кали (или едкого натра). Раствор краски может долго сохраняться; по истечении не­которого времени красит лучше, чем свежеприготовлен­ный.

Карболовый генцианвиолет. К 10 мл на­сыщенного спиртового раствора краски добавляют 100 мл 5%-ного водного раствора фенола. Раствор вы­держивают 2—3 дня в термостате.

Люголевский раствор. Не является краси­телем. Основная составная часть его — кристаллический йод. Раствор употребляется при окрашивании по Граму. Для приготовления раствора 1 г кристаллического йода и 2 г йодистого калия растворяют 300 мл дистил­лированной воды. Иод плохо растворяется в воде, по­этому необходимо сначала в 5—10 мл воды растворить йодистый калий, затем прибавить кристаллический йод и только после полного растворения йода добавить дис­тиллированную воду, доводя объем до 300 мл. Раствор фильтруют и хранят в склянке оранжевого цвета в про­хладном месте.

Приготовленные растворы красок, как правило, фильтруют через бумажные фильтры. Чтобы убедиться, что после фильтрации в растворе нет нерастворенных частиц красок, несколько капель этого раствора нали­вают на чистое предметное стекло, через 2—3 мин крас­ку смывают водой, стекло просушивают фильтроваль­ной бумагой и просматривают под иммерсионным объек­тивом. При наличии нерастворенных частиц, обнаружи­вающихся в виде отдельных глыбок, необходимо по­вторно профильтровать раствор красок. При отсутствии осадка в растворе предметное стекло слабо и равномер­но окрашивается проверяемым красителем. Часто при бактериоскопическом исследовании упот­ребляют смесь двух или нескольких красок (краски Ро­мановского-— Гимза, Лейшмана и др.).

Рабочие растворы красок наливают во флаконы, снабженные пипеткой с резиновым баллончиком на верх­нем конце. На каждом флаконе обязательно должна быть этикетка с надписью названия краски. Флаконы с раствором красок устанавливают в гнезда специальной Деревянной колодки, находящейся на рабочем столе микробиолога.

Выделяют простые и сложные (дифференцирующие) методы окра­ски.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание препа­ратов каким-либо одним красителем. Чаще всего при этом использу­ется фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый синий. В случае использования негативных красителей среда, в которой находятся микроорганизмы, становится полупрозрачной; в результате клетки, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частицы на равномерно окрашенном фоне. Некоторые микроорганизмы, напри­мер спирохеты, плохо выявляемые с помощью позитивных красите­лей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями. Споры имеют вид преломляющих свет включений в вегетативной клетке.

Техника приготовления препарата заключается в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, которые лежат над кюветой. На мазок наносят 1 % водный рас­твор фуксина на 1 – 2 мин или метиленового синего на 3– 5 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают, промокая его фильтровальной бумагой, наносят на окрашенный сухой мазок каплю иммерсионного масла и микроскопируют с иммерсион­ной системой.

Сложные (дифференцирующие) методы окра­ски. Сущность метода – на мазок воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых на­зывается основным (главным), другие – дополнительными (контрастными). После действия первого раствора красителя мазок в зависимости от способа окраски обесцвечивают спиртом, кисло­той, щелочью, ацетоном и др. К обесцвечивающим веществам микробы относятся по-разному. Одни из них являются кислото- и спиртоустойчивыми, другие – только кислотоустойчивые, третьи – не устойчивые к этим веществам.

Отношение бактерий к окраске по Граму коррелирует с ря­дом других признаков. Как правило, грамположительные формы бактерий отличаются от грамотрицательных химическим соста­вом веществ оболочек и цитоплазмы, содержанием РНК и ДНК в клетке, изоэлектрическим состоянием цитоплазмы, чувстви­тельностью к антибиотическим веществам и т. д. Отношение бак­терий к окраске по Граму может изменяться в зависимости от возраста культуры, ее состояния и условий выращивания.

Для определения отношения микроорганизма к окраске по Граму следует использовать молодые, лучше суточные культуры, так как микроорганизмы из старой или погибающей культуры неодинаково интенсивно красятся по Граму. Мазки, нанесенные на стекло, должны быть по возможности тонкими и ровными. При толстом мазке дифференциация его будет затруднена и грамотрицательные формы бактерий могут выглядеть грамположительными.

Окраска бактерий по Грамму

Окраска положена в основу дифференциа­ции бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удержи­вать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и иода либо терять его после обработки спиртом.

Принцип окраски

· у первой группы микроорганизмов при окрашивании растворами красителей трифинилметанового ряда (генцианвиолет, кристаллвиолет) в присутствии йода образуется прочное соединение, не разрушающееся при последующем обесцвечивании спиртом. При этом микробные клетки остаются окрашенными в темно-синий цвет. Грамположительные бактерии (положительно красящиеся по Грамму) окрашиваются в фиолетовый цвет.

· Микробы второй группы при воздействии спиртом обесцвечиваются и воспринимают дополнительную окраску, т.е. не красятся по Граму. Грамотрицательные бактерии (отрицательно красящиеся) окрашиваются в розовый цвет (цвет дополнительной окраски – в данном случае фуксина).

Различное отношение к окраске по Грамму связано с наличием в цитоплазме грамположительных бактерий значительного количества магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которая образует с генцианвиолетом и йодом нерастворимый в спирте комплекс. Также играет роль неодинаковая проницаемость для комплекса краситель-йод клеточной стенки и цитоплазматической мембраны в связи с различием химического состава и структуры их у этих двух групп бактерий.

Материалы и оборудование.

Предметные стекла, микробиологическая петля, спиртовка, кристаллизатор с подставкой для препаратов, промывалка с водой, микроскоп, чис­тые суточные культуры микроорганизмов. Хорошими объектами для окраски клеток микроорганиз­мов по Граму служат дрожжи, Bacillus mesentericus или Bacillus subtilis (грамположительные) и кишечная палочка Escherichia coli (грамотрицательная). Выде­ляют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Strep­tococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы.

Красители и реактивы для окраски по Граму:

1. Феноловый рас­твор генциана фиолетового, генциан фиолетовый — 1 г, спирт 96%-ный — 10 мл, фенол кристаллический — 2 г, вода дистил­лированная — 100 мл.

В некоторых случаях применяют спиртовой раствор генциана фиолетового: генциан фиолетовый (или кристаллический фи­олетовый) — 1 г, спирт 96%-ный (ректификат) — 100 мл, гли­церин — 5 мл. Бутыль со смесью ставят в термостат на 24 ч (можно и дольше), затем фильтруют.

2. Раствор Люголя (иодид калия — 2 г, иод кристаллический — 1 г, вода дистиллированная — 300 мл). Вначале готовят кон­центрированный раствор иодида калия в 5 мл воды, в нем растворяют иод, потом добавляют воду до 300 мл.

3. Спирт 96%-ный.

4. Фуксин Пфейфера (водный раствор карболового фуксина Циля): 1 мл карболового фуксина Циля (см. 3.2.2) и 9 мл дистил­лированной воды.

5. или готовый набор реактивов для окраски по Грамму (Основной вариант).

Ход работы.

1. На хорошо обезжиренное предметное стекло наносят исследуемый материал.
2. Приготовленный мазок высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем, медленно проводя препарат мазком вверх 3-5 раз. Затем мазок остужают
3. На фиксированный мазок наливают, раствор красителя генцианвиолет и выдерживают в течение 1-2 минут. Затем краситель сливают.
4. На мазок наливают раствор Люголя. Выдерживают в течение 1-2 минут. Затем раствор сливают, мазок промывают рабочим раствором спирта этилового по 15-20 секунд 2-3 раза до полного отхождения облачков краски. При этом препарат становится серым. Затем мазок промывают водой.
5. На промытый мазок наливают раствор фуксина Циля. Выдерживают 2 минуты.
6. С окрашенных мазков стряхивают краситель, промывают водопроводной водой. Мазки высушивают на воздухе и микроскопируют. При микроскопировании используют иммерсионное масло.

Модификации окраски по Грамму:

1. Покрывают фиксированный мазок полоской фильтровальной бумаги,

на которую наносят карболовый раствор генцианового фиолетового, держа стекло в слегка наклонном положении. Окрашивание проводят на протяжении 1 - 2 мин.

1. Фильтровальную бумагу удаляют, раствор красителя сливают (не промывая препарат водой).
2. На мазок двукратно наносят раствор Люголя (стекло и в этом случае лучше держать в наклонном положении первый раз, чтобы смыть остатки красителя с мазка (при этом раствор не задерживают на мазке, а сразу же при легком покачивании стекла сливают), вторую порцию раствора выдерживают 2-3 мин. (до почернения мазка), затем сливают.
3. Окрашенный мазок обесцвечивают 96°- этиловым спиртом (препарат непрерывно покачи­вают 15-20 сек. до прекращения отхождения фиолетовых струек). Обесцве­чивание проводят не более 30 сек – в зависимости от толщины мазка – пока мазок не станет серо-стального цвета. Очень важно четко придерживаться времени обесцвечивания, так как при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки. Следует учесть, что ацетон действует почти мгновенно, 95%-ный этанол обладает более медленным действием. Дифференциацию мазка прекращают, когда закончится вымывание красителя из препарата.

7. Препарат промывают водой.

8. Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1 - 2 мин водным раствором фуксина Пфейфера.

После этой обработки грамположительные микроорганизмы приобретают темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные окрашиваются лишь в цвет дополнительной окраски (фуксина).

Результаты окраски по Граму зависят от возраста культу­ры: в старых культурах мертвые клетки всегда окрашиваются грамотрицательно. Поэтому лучше использовать молодые односуточные культуры. Некоторые бактерии окраши­ваются грамвариабельно, т. е. часть клеток — как грамположительные, а часть — как грамотрицательные.

1. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой. На препарате грамположительные бактерии окрашиваются в сиренево-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в розово-ма­линовый.

Метод Грама в модификации Синева. Раствор краски карболового кристаллвиолета или генцианвиолета заменяют на бумагу, приготовленную по Синеву. На фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги шириной 3 см, предварительно пропитанную 1%-ным спиртовым раствором кристаллического фиолетового и высушенную. На бумагу наносят 2—3 капли дистиллированной воды, придавливают пинцетом к стеклу, чтобы она равномерно пропиталась жидкостью и хорошо прилегла к мазку, и оставляют ее на препарате 2 мин. Через 2-3 мин. Бумагу снимают пинцетом, продолжают обычную обработку р-ром Люголя, спиртом, водой и дополнительно докрашивают. Модификацию Синева широко применяют на практике. Данный метод удобен тем, что препараты при этом свободны от осадков красящего раствора, а краски расходуется меньше.

Метод Грама в модификации Калины. На предметное стекло наносят небольшую каплю дистиллированной воды, помещают в нее минимальное количество клеток микроорга­низмов и петлей добавляют 0,5%-ный спиртовой раствор кристаллического фиолетового. Суспензию равномерно распределяют на площади 1 см², подсушивают и фиксируют однократным проведением над пламенем горелки. После этого препарат в течение 1 мин обрабатывают реактивом, содержащим 10 мл 5%-ного раствора фуксина Пфейфера, 10 мл. 10%-ного раствора иода, 10 мл ацетона и 70 мл 0,5%-ного раствора иодида калия. Затем препарат опускают на мгновение в 96%-ный этиловый спирт и быстро высушивают фильтровальной бумагой.

ПРОВЕДЕНИЕ ЗАНЯТИЯ

Теоретические вопросы окрашивания микроорганизмов

2. Демонстрация анимации «Окраска по Граму»

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: