Особенности культивирования облигатно-анаэробных бактерий

Облигатными анаэробами называют микроорганизмы, облада­ющие ферментативным метаболизмом и не растущие на поверхнос­ти аэрируемой питательной среды.

В зависимости от отношения к свободному кислороду облигатные анаэробы делят на умеренные и строгие. Большинство значи­мых для медицинской микробиологии анаэробов (клостридии, бак­тероиды, фузобактерии, пептококки и др.) относятся к категории умеренных. Они толерантны к кислороду в течение нескольких де­сятков минут и не растут при его концентрации в среде более 3%. Строгие анаэробы (метанобактерии и др.) чрезвычайно чувствитель­ны к токсическому действию кислорода и не растут при его содержа­нии в среде более 0,5%.

Биологические особенности облигатных анаэробов обусловлива­ют необходимость применения специальных методов культивирова­ния, отличающихся от используемых при работе с аэробными и фа­культативно-анаэробными микроорганизмами.

Важным условием, которое необходимо соблюдать на всех эта­пах выделения и идентификации анаэробов, является защита этих микроорганизмов от токсического действия молекулярного кисло­рода. Время между взятием материала и его посевом на питательные среды должно быть максимально коротким. Для защиты содержа­щихся в патологическом материале облигатных анаэробов от воз­действия атмосферного кислорода используют специальные транс­портные среды.

Анаэробные бактерии можно культивировать только на специ­альных бескислородных питательных средах с низким окислитель­но-восстановительным потенциалом (-10-150 мВ). Для контроля за степенью насыщения этих сред кислородом используют специальные редокс-индикаторы (метиленовый синий, резазурин), восстановлен­ные формы которых бесцветны. При возрастании окислительно-вос­становительного потенциала (ОВП) метиленовый синий окрашива­ет среды в синий, а резазурин - в розовый цвет, что указывает на непригодность таких питательных сред для культивирования облигатных анаэробов.

Для сохранения низкого ОВП питательные среды должны быть агаризованы. Добавление даже 0,05% агара повышает их вязкость и уменьшает ее аэрацию. Для получения роста облигатно - анаэроб­ных бактерий плотные питательные среды должны быть свежеприготовленными (не позднее двух часов после приготовления) или прередуцированными (выдержаны в анаэростате не менее суток). Для успешного выращивания анаэробов требуется внесение большого количества посевного материала. Это связано с тем, что в больших концентрациях облигатные анаэробы способны быстрее уменьшать ОВП среды и тем самым создавать благоприятные условия для своего роста.

Анаэробный тип дыхания во много раз менее продуктивный, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть значительно богаче питательными субстратами и витаминами. В ка­честве питательной основы они содержат различные экстракты и бел­ковые гидролиза (сердечно-мозговой и печеночный настои, дрож­жевой и соевый экстракты, пептон, триптон, гидролитический пере­вар казеина и др.), факторы роста (гемин, менадион, твин-80, сукцинат натрия и др.), цельную или лизированную кровь. Для выделения различных анаэробов из смеси культур к питательным средам добавляют желчь, азид натрия, антибиотики, налидиксовую кислоту, малахитовый зеленый и другие ингредиенты. В практических лабора­ториях для выделения анаэробов из патологического материала чаще всего используют среду для контроля стерильности (СКС), среду Китта - Тароцци, анаэробный кровяной агар (на основе эритрит-агара или агара Д), среду Вильсона-Блера и некоторые другие с соответству­ющими добавками.

Методы создания анаэробных условий

Необходимым условием культивирования анаэробных бактерий является создание анаэробных условий, что достигается с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов.

Физические методы

1. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят их регенерацию путем кипячения в течение 15-20 мин на водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 45 – 50 ^оС

После посева для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.

2. Посев содержащего анаэробы патологического материала в высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, которая разливается в пробирки в объеме 10 -12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5-2,0 см от поверхности, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.

3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из герметически закрытых сосудов (анаэростатов, анаэроб­ных боксов) с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азот, аргон, гелий) или бескислородной газовой смесью, состоящей из 80% азота, 10% двуокиси углерода и 10% водо­рода. В ряде случаев используют природный (магистральный) газ. Для поглощения остатков кислорода из газовой смеси используют палладиевый катализатор. Для поглощения водяных паров на дно анаэростата помещают 5-6 г хлористого кальция, 10-12 г силикагеля или 20-30 г хлористого натрия.

Химические методы

1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглоще­ния кислорода в замкнутой воздушной среде. Для поглощения кис­лорода из 220 мл воздуха применяют смесь, состоящую из 1 мл 20% раствора пирогаллола и 1 мл насыщенного раствора карбоната на­трия Na₂CO₃.

2. Для поглощения кислорода из замкнутого пространства мож­но применять гидросульфит натрия. Для связывания кислорода в 1 л объема берут 100 мл свежеприготовленного 20% раствора Na₂S₂O₄ и 16 мл 50% КОН. Эти реагенты связывают кислород быстрее, чем пи­рогаллол.

3. Для связывания остатков кислорода в предназначенных для роста анаэробов питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота или тиогликолат натрия (0,01-0,02%), аскорбиновая кислота (0,1%), различные сахара (0,1-3%), цистин и цистеин (0,03-0,05%), муравьинокислый натрий (0,25 -0,75%) и др.

4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, экси­каторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах).

Для образования водорода и двуокиси углерода, необходимых для роста облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород, генерируе­мый таблетками боргидрида натрия, связывает кислород воздуха присутствии палладиевого катализатора с образованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия. Этот метод особенно удобен при работе в военно-полевых условиях.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: