Задание 1. Определение наличия вещества в растворе методом осаждения (на примере осаждения белков из раствора сульфосалициловой кислотой).

Принцип метода. Белки легко осаждаются из водного раствора минеральными, органическими кислотами и солями тяжёлых металлов. Денатурация и осаждение белка кислотами обусловлены нейтрализацией поверхностного заряда коллоидных частиц белка, разрушением гидратационной оболочки белковых молекул и образованием комплексных солей белка с кислотами. Тяжёлые металлы образуют стойкие комплексы с SH-гуппами белков, что вызывает изменения структуры и растворимости белка. Особенно чувствительной реакцией на наличие белка в растворе является осаждение трихлоруксусной и сульфосалициловой кислотой (чувствительность последней реакции составляет 1:50000). Кроме того, сульфосалициловая кислота наряду из высокомолекулярными белками, способна осаждать низкомолекулярные белки и продукты распада белков – полипептиды и олигопептиды.

Ход работы. В пробирку наливают 1,0 мл исследуемого раствора белка и добавляют 3-5 капель 20%-го раствора сульфосалициловой кислоты. Наблюдают образование осадка белка.

Клинико-диагностическое и практическое значение. Реакция с сульфосалициловой и трихлоруксусной кислотой используется для качественного и количественного определения белка в моче.

Способность белка прочно связывать ионы тяжёлых металлов используется в клинической практике. Белок используют как противоядие при отравлениях солями ртути, свинца и т.п. При отравлении солями тяжёлых металлов больному дают большое количество белка (яичного белка или молока). В желудке образуются нерастворимые комплексы металлов с белками, вследствие чего прекращается всасывание ядов и их поступление в кровь, уменьшается интоксикация и усиливается их выведение из организма.

Задание 2. Определение наличия вещества в растворе по специфической цветной реакции; на примере биуретовой реакции определения пептидной связи в растворе белка после частичного гидролиза (1, 6, 12 часов).

Принцип метода. Биуретовая реакция – характерная реакция для соединений, содержащих в своём составе не менее двух пептидных связей. Такие соединения в щелочной среде образуют с медным купоросом комплекс, розово-фиолетового цвета. В образовании этого комплекса принимают участие пептидные связи в энольной форме.

Биуретовая реакция служит доказательством наличия пептидных связей в белках и пептидах.

Ход работы. В пробирку № 1 вносят 1 мл исследуемого раствора белка, в пробирку № 2 – 1 мл гидролизата белка (1 час), в пробирку № 3 – 1 мл гидролизата белка (6 час.), в пробирку № 4 – 1 мл гидролизата белка (12 час.). В каждую пробирку добавляют по 5 капель 10%-го раствора NaOH и по 5 капель 1%-го раствора сульфата меди (CuSO₄). Появление фиолетовой окраски (биуретовая реакция) свидетельствует о наличии в растворе белка или полипептидов. Интенсивность окраски изменяется в зависимости от времени гидролиза.

На основании проведенного эксперимента сделать выводы исходя из изменений интенсивности окраски.

Литература

Основная:

1. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 2000. - 704с.

2. Хмелевский Ю.В, Губский Ю.И., Зайцева И.Д. и др. Биологичес­­­кая химия: Практикум. - К.: Вища шк., 1985. - 212 с.

Дополнительная:

1. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3 т.- М.: Мир, 1985. ­­­ - 1056 с.

2. Мак-Мюррей В. Обмен веществ в человека. - М.: Мир, 1980. ­­­ - 368 с.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2 т. - М.: Мир, 1993. - т.1 - 381 с.; т.2 - 414 с.

Ферменты и коферменты. регуляция метаболизма.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: