Задание 2. Исследовать влияние фосфакола и ионов кальция на активность холинэстеразы.

Принцип метода. Холинэстераза катализирует реакцию гидролиза нейромедиатора – ацетилхолина с образованием холина и уксусной кислоты. В крови человека содержится два вида холинэстеразы. В сыворотке содержится неспецифическая псевдохолинэстераза, которая расщепляет не только ацетилхолин, но и эфиры холина. В эритроцитах содержится специфическая, истинная ацетилхолинэстераза, которая расщепляет только ацетилхолин.

Фосфорорганические соединения (ФОС, фосфакол) являются необратимыми ингибиторами холинэстеразы и ацетилхолинэстеразы, поскольку ковалентно связываются с активным центром фермента и тормозят его активность. Препараты ФОС являются высокотоксичными ядами для насекомых (пестициды) и теплокровных животных. Механизм ингибирующего действия заключается в связывании с ОН группой серина в активном центре фермента.

Возрастание концентрации ионов Са²⁺ в нервном окончании является непосредственным биохимическим сигналом, который вызывает активацию выхода ацетилхолина через пресинаптическую мембрану, его взаимодействие с холинорецепторами постсинаптической мембраны и расщепление медиатора в синаптической щели ацетилхолинэстеразой. Поэтому ионы кальция являются мощным активатором холинэстеразы.

Метод количественного определения холинэстеразы основан на титровании щёлочью уксусной кислоты, которая высвобождается в процессе гидролиза ацетилхолина. Количество щёлочи, использованной на титрование, является мерой активности фермента.

Ход работы. Три пробирки заполняют реактивами согласно таблице:

По результатам проведенного эксперимента сделать выводы.

Клинико-диагностическое и практическое значение. Физиологически активные соединения, являющиеся ингибиторами ацетилхолинэстеразы, имеют важное фармакологическое и токсикологическое значение, поскольку вызывают значительное увеличение концентрации нейромедиатора как в структурах центральной нервной системы, так и в организме в целом.

Обратимые ингибиторы ацетилхолинэстеразы применяются в медицине с целью увеличения активности холинэргической импульсации, нарушенной при определённых неврологических заболеваниях, таких как атония кишечника, мочевого пузыря. С этой целью применяются препараты: прозерин, физостигмин, галантамин.

Необратимые ингибиторы ацетилхолинэстеразы являются мощными нервными ядами, которые вызывают резкое возбуждение нервной системы с судорогами, нарушением функции сердечно-сосудистой, гастро-интестинальной и других физиологических систем организм. Наиболее распространенными необратимыми ингибиторами являются фосфорорганические соединения – ФОС. В сельском хозяйстве для борьбы с вредными насекомыми используют: хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос и т.п. Нервно-паралитическими ядами, которые применяются как боевые отравляющие вещества, являются табун, зарин, зоман и т.д.

Высокая чувствительность холинэстеразы к действию фосфорорганических соединений делает её специфическим биохимическим маркером для выявления влияния этих ядов на организм человека.

Литература

Основная:

1. Хмелевский Ю.В, Губский Ю.И., Зайцева И.Д. и др. Биологичес­­­кая химия: Практикум. - К.: Вища шк., 1985. - 212 с.

2. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 2000. - 704с.

Дополнительная:

1. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. В 2 т. – М.:Мир, 1982.

2. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3 т.- М.: Мир, 1985. ­­­ - 1056 с.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2 т. - М.: Мир, 1993. - т.1 - 381 с.; т.2 - 414 с.

4. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. – М.: Мир. – 1980. – 364 с.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: