Главная

Популярная публикация

Научная публикация

Случайная публикация

Обратная связь

ТОР 5 статей:

Методические подходы к анализу финансового состояния предприятия

Проблема периодизации русской литературы ХХ века. Краткая характеристика второй половины ХХ века

Ценовые и неценовые факторы

Характеристика шлифовальных кругов и ее маркировка

Служебные части речи. Предлог. Союз. Частицы

КАТЕГОРИИ:






Практическая часть.




И Н С Т Р У К Ц И Я

По выполнению практической работы № 65 по теме

«Химия крови. Определение уровня средних молекул в сыворотке крови».

Цели занятия:

1. Закрепить теоретические знания по темам «Химия крови» и «Химия белка».

2. Закрепить умения и навыки в работе с реактивами, оборудованием, посудой.

3. Провести биохимическое исследование – определение уровня средних молекул в сыворотке крови.

 

 

Исходный уровень знаний и умений.

Учащийся должен знать:

1. Понятие о крови как единой биохимической системе в организме человека.

2. Основные компоненты крови, их биологическую роль.

3. Патологию обмена белков: изменения уровня белка и/или остаточного азота в крови (гипо- и гиперпротеинемии, азотемии).

4. Патологические состояния, наблюдаемые в биохимической картине крови.

5. Роль лабораторной диагностики в исследовании крови как важнейшего источника сведений о состоянии здоровья человека.

 

Учащийся должен уметь:

1. Работать с химической посудой, пипетками, дозатором и др.

2. Работать с центрифугой, на спектрофотометре.

3. Приготовить необходимые реактивы и растворы для биохимического исследования.

4. Провести биохимическое исследование по предложенной методике.

5. Дать начальную интерпретацию полученному результату.

 

Структура занятия.

1. Теоретическая часть:

 

Повторение теоретического материала по темам «Химия крови» и «Химия белка».

Рассказ преподавателя.

К числу веществ белковой природы, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой и по этой причине могущих быть отнесёнными к компонентам остаточного азота, причисляют в настоящее время так называемые молекулы средней массы, или средние молекулы. Интерес к исследованию этих молекул определяется тем, что они – важные универсальные факторы интоксикации. Химическая природа среднемолекулярных токсинов до сих пор точно не установлена. Известно, что они представляют собой олигопептиды с высоким содержанием дикарбоновых аминокислот, цистеина, лизина и глицина и низким содержанием ароматических аминокислот.

Оказывающие токсический эффект молекулы средней массы были выделены из диализной жидкости больных с хронической почечной недостаточностью.

Среднемолекулярные пептиды включают в себя гормоны, нейропептиды, медиаторы иммунного ответа и многие другие продукты белкового обмена, в целом определяющие высокую биологическую активность среднемолекулярных пептидов.

Если вначале к среднемолекулярным пептидам относили лишь простые и сложные пептиды, гликопептиды и нуклеопептиды, то в настоящее время – некоторые гуморальные регуляторы, в том числе инсулин, глюкагон, различные «тропины» и их комплексы, некоторые витамины, нуклеотиды и др.

Значительную часть средних молекул составляют продукты распада фибрина, витамины, поступающие в кровь из ЖКТ, а также метаболиты, образующиеся в процессе распада эндогенных белков. Состав среднемолекулярных пептидов различен в зависимости от вида патологии, характера осложнений. Концентрация средних молекул в плазме может зависеть от развития инфекции, уровня гипергидратации, особенностей лекарственной терапии и диеты. Для выделения из плазмы (сыворотки) крови средних молекул с успехом могут быть использованы способы ультрафильтрации на мембранах, гель-фильтрация на колонках, заполненных сефадексом G-15, а также методы, базирующиеся на различии в растворимости отдельных компонентов среднемолекулярных пептидов в спиртах и способности молекул средней массы не осаждаться трихлоруксусной кислотой.

В клинической практике доступными являются скрининговый метод (модификация А. Бабеля с соавторами, 1974) и модифицированный способ определения веществ группы средних молекул в биологических жидкостях.

 

 

2. Указания к занятию. Методические рекомендации:

Внимательно изучите инструкцию.

Приготовьте всё необходимое оборудование, реактивы для проведения анализа.

Осмыслите ход выполнения лабораторной работы.

Соблюдайте меры предосторожности в работе с реактивами, био-логическим материалом, на спектрофотометре.

При работе с градуированной пипеткой используйте резиновую грушу с передником.

Соблюдайте дезинфекционный режим в работе.

 

 

Практическая часть.

Лабораторная работа: «Определение уровня средних молекул в сыворотке крови».

a) Скрининговый метод определения уровня средних молекул (модификация А. Бабеля с соавторами, 1974).

ПРИНЦИП: Метод основан на освобождении сыворотки (или плазмы) крови от содержащихся в ней высокомолекулярных пептидов и белков с использованием ТХУ и количественном определении в полученной после центрифугирования надосадочной жидкости уровня среднемолекулярных пептидов по поглощению в монохроматическом световом потоке при длине волны 254 нм.

 

Реактивы: раствор ТХУ (100 г/л). Хранится в посуде из тёмного стекла при 4-10°C. Готовится путём разбавления дистиллированной водой более концентрированного раствора (500 г/л).

 

Оборудование: спектрофотометр, позволяющий измерять оптическую плотность в ультрафиолетовой области спектра (250-260 нм) с использованием стандартных прямоугольных кварцевых кювет с длиной оптического пути 1 см; центрифуга; пробирки; пробирки центрифужные; штатив; пипетки.

Материал для исследования: сыворотка (плазма) крови или моча.

 

Ход определения.

В центрифужную пробирку вносят 1,0 мл сыворотки (или мочи) и 0,5 мл ТХУ. После перемешивания содержимого производят центрифугирование при 3000 об/мин. в течение 30 мин. Отбирают 0,5 мл надосадочной жидкости и переносят в пробирку с 4,5 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирки перемешивают и фотометрируют при длине волны 254 нм, используя в качестве контрольной пробы дистиллированную воду.

Результаты выражают в условных единицах, представляющих собой показатели оптической плотности, учтённые с точностью до третьего знака после запятой.

 

Референтные пределы: уровень среднемолекулярных пептидов в пробах сыворотки крови – 0,240 ± 0,02 ед., в пробах мочи – 0,319 ± 0,15 ед.

Примечание: При исследовании мочи рекомендуется разводить субстрат дважды, т.е. из 5 мл первоначально поученного раствора отбирать 0,5 мл с последующим внесением этого объёма к 4,5 мл дистиллированной воды.

 

б) Модифицированный способ определения веществ группы средних молекул в биологических жидкостях.

 

ПРИНЦИП: Метод основан на осаждении высокомолекулярных белков плазмы крови действием хлорной кислоты и этилового спирта с последующей фотометрией при длине волны 210 нм.

 

Реактивы: 1,2 моль/л раствора хлорной кислоты (13,8 мл хлорной кислоты х.ч. довести дистиллированной водой до 100 мл); 2 моль/л раствора калия углекислого; 96% раствор этилового спирта.

 

Оборудование: центрифуга; спектрофотометр (позволяющий выделить длину волны 210 нм); пробирки; пробирки центрифужные; штатив; пипетки; ледяная баня.

Материал для исследования: плазма или сыворотка крови.

 

Ход определения.

В центрифужную пробирку помещают 0,5 мл плазмы (сыворотки) крови, добавляют 0,5 мл хлорной кислоты (реактив I), тщательно перемешивают встряхиванием, оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин., затем центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 10-15 мин. Отбирают 0,5 мл центрифугата в пробирку, в которую добавляют 0,1 мл раствора углекислого калия (реактив II). Пробирку выдерживают в ледяной бане в течение 20 мин.

Пробу центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 10-15 мин. Отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости в центрифужную пробирку, добавляют 0,8 мл этанола, встряхивают, оставляют на 10 мин. при комнатной температуре, затем центрифугируют 10 мин. при 3000 об/мин. (для осаждения высокомолекулярных примесей). Отбирают 0,5 мл центрифугата и добавляют 4,5 мл дистиллированной воды. Перемешивают. Фотометрируют при длине волны 210 нм относительно контрольной пробы.

К о н т р о л ь н а я п р о б а: 0,2 мл дистиллированной воды и 0,8 мл этилового спирта; отбирают 0,5 мл этого раствора и добавляют 4,5 мл дистиллированной воды.

 

Расчёт: Показатель оптической плотности пробы при длине волны 210 нм умножают на 3,94 – коэффициент пересчёта результата (в г/л) с учётом разведения биологической жидкости.

 

Референтные пределы: концентрация средних молекул в плазме крови у практически здоровых взрослых людей – 0,53 ± 0,02 г/л.






Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

vikidalka.ru - 2015-2024 год. Все права принадлежат их авторам! Нарушение авторских прав | Нарушение персональных данных