Лабораторна робота № 1. Тема: Сучасні методи мікроскопічного дослідження мікроорганізмів

Тема: Сучасні методи мікроскопічного дослідження мікроорганізмів. Просте забарвлення

Мета: Знайомство з особливостями роботи в мікробіологічній лабораторії. Вивчення типів сучасних мікроскопів, освоєння способів мікроскопії, правил роботи з імерсійною системою. Підготовка препаратів живих і фіксованих пофарбованих кліток мікроорганізмів.

Матеріали й устаткування: природні субстрати (кисляк, кефір, настій сіна, біогумусу, розсіл квашеної капусти, цвіль та ін.), мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки на 1-2 мл, бактеріологічна петля, пінцет, тонкі предметні й покривні стекла, у тому числі з лункою, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, розчини метиленового синього (1:40), фуксину основного, генціанвіолета, імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, дезинфікуючий розчин, дистильована вода.

Для вивчення морфології мікроорганізмів у прохідному світлі використовують оптичні мікроскопи МБР (рис. 1.1), МБД.

Механічна частина складається зі штатива з предметним столиком, тубуса, револьвера, механізму наведення різкості, що складається з макрометричного й мікрометричного гвинтів.

Оптична частина мікроскопа включає об'єктив і окуляр. Об'єктив є найважливішою частиною мікроскопа. Він складається із системи лінз, укладених у металеву оправу. Одне з позначень на оправі відповідає значенню збільшення об'єктива. В мікроскопі МБР використовуються об'єктиви, що дають збільшення в 8, 40 і 90 разів. Збільшення об'єктива залежить від фокусної відстані головної – фронтальної лінзи. Чим більше кривизна фронтальної лінзи, тим коротша фокусна відстань, тобто тим нижче треба опускати об'єктив над площиною препарату. Інші лінзи називаються корекційними, вони необхідні за для усунення сферичної й хроматичної аберації. Окуляр містить дві лінзи: - очну (верхню) і збірну (нижню). Окуляри можуть давати збільшення в 5, 7, 10, 12, 15 і 20 разів, що зазначено на їх оправі.

Освітлювальна система включає дзеркало з двома поверхнями (увігнутою та плоскою) і конденсора (у мікроскопі МБД є убудоване джерело світла). Увігнуте дзеркало збирає й концентрує в площині препарату пучок рівнобіжних променів світла, що йдуть від джерела світла, тому їм користаються в тих випадках, коли працюють без конденсора, тобто з малим збільшенням.

Конденсор, укріплений безпосередньо над дзеркалом, складається з двох лінз і призначений для збирання паралельних променів світла, відбитих дзеркалом, у крапці-фокусі, що знаходиться в площині препарату. Убудована в конденсор ірисова діафрагма слугує для затримання зайвих променів світла і дозволяє при необхідності зменшувати апертуру конденсора.

Рис. 1.1. Мікроскоп МБР-1:

1 – основа мікроскопа; 2 – предметний столик; 3 – гвинти для переміщення предметного столику; 4 – клеми для фіксації препарату; 5 – конденсор; 6 – кронштейн конденсора; 7 – гвинт, що закріплює конденсор у гільзі; 8 – гвинт переміщення конденсора; 9 – ручка ірисової діафрагми конденсора; 10 – дзеркало: 11 – тубусоутримувач; 12 – макрометричний гвинт (кремальєра);13 – мікрометричний гвинт: 14 – револьвер; 15 – об’єктиви; 16 –тубус; 17 –гвинт для кріплення тубуса; 18 – окуляр

Загальне збільшення, що дає мікроскоп, визначається добутком збільшення об'єктива на збільшення окуляра. Виразність одержуваного зображення характеризується дозвільною здатністю, що залежить від довжини хвилі використовуваного світла (l) і суми числових апертур об'єктива (A₁) і конденсора (A₂). Дозвільна здатність мікроскопа – величина, зворотна дозвільної відстані (d), що визначається мінімальною відстанню між двома крапками, коли вони ще не зливаються в одну.

Величина дозвільної відстані мікроскопа визначається наступним чином:

. (1.1)

Числова апертура визначається добутком синуса половини кута охоплення лінзи та показника заломлення середовища (n), що граничить із лінзою: A = sin U·n. Тобто числова апертура характеризується кількістю променів, що попадають у лінзу (рис. 1.2).

Чим більша дозвільна здатність, тим меншої величини об'єкт можна побачити. Світловий мікроскоп за умов використання видимого світла має дозвільну відстань близько 0,2 мкм.

Рис 1.2. Схема ходу променів із різною величиною отвірного кута:

А – об’єкт; О – об’єктив;

a – отвірний кут; U – половина

отвірного кута

Підвищити дозвільну здатність можна двома шляхами: висвітлюючи об'єкт більш короткими променями світла, наприклад, УФ, або, збільшуючи показник заломлення середовища, що граничить із лінзою, для того, щоб наблизити його до показника заломлення скла (n скла =1,5). У вивченні мікроорганізмів майже постійно користаються імерсійним, або олієзануреним об'єктивом (90х), що дає збільшення у 900-1350 разів (рис. 1.3). Тому всі промені, не переломлюючись і не змінюючи свого напрямку, потрапляють в об'єктив і забезпечують гарну видимість дрібних об'єктів.

Рис 1.3. Вплив імерсійної олії на хід променів у мікроскопі:

1 – об’єктив; 2 – предметне скло; 3 – об’єкт;

4 – імерсійна олія; 5 – промені світла;

6 – фронтальна лінза об’єктива

Мікроскопія в темному полі

Мікроскопія в темному полі

Для дослідження об'єктів малої величини використовують темнопольну мікроскопію. Для цього в біологічному мікроскопі звичайний конденсор заміняють спеціальним конденсором темного полю, що має затемнену середню частину і пропускає тільки бічні промені. Таким чином, мікроскопія в темному полі заснована на висвітленні об'єкта косими променями світла.

Рис. 1.4. Схема ходу променів у конденсорі темного поля:

1 – лінза конденсора;2 – чорна

пластинка; 3 – об’єктив

Ці промені, не потрапляючи в об'єктив, залишаються невидимими для ока, тому поле зору виглядає зовсім чорним (рис. 1.4). Якщо препарат містить якісь частки, наприклад, м/о, то косі промені, проходячи через такий препарат, значною мірою відбиваються від поверхні цих часток і, ухиляючись від свого первісного напрямку, попадають в об'єктив. Тоді спостерігач бачить на чорному фоні інтенсивно світні об'єкти з різким бічним контрастом. При цьому апертура конденсора повинна бути трохи більшою апертури об'єктива (об'єктив необхідно діафрагмувати, а конденсор імергувати).

Фазово-контрастна мікроскопія

Більшість препаратів живих м/о слабко контрастні, тобто клітини мало відрізняються за забарвленням і прозорістю від навколишнього середовища.

Проте світлова хвиля набуває певних змін: проходячи через ділянки препарату, що мають більший, ніж у навколишнього середовища показник заломлення, вона виходить із деяким відставанням за фазою. Спеціальний фазово-контрастний пристрій дозволяє оптичним шляхом перетворювати розходження за фазою в зміни амплітуди, у результаті чого живі прозорі об'єкти стають контрастними, їх можна побачити оком.

Оптична система, яка використовується для одержання фазового контрасту, складається з фазової пластинки в одній з лінз об'єктива, що має форму кільця, і кільцевої діафрагми в спеціальному конденсорному пристрої. Для одержання фазового ефекту необхідно точне сполучення фазового кільця з проекцією кільцевої діафрагми (рис. 1.5).

Рис. 1.5. Схема ходу промінів із використанням фазово-контрастного пристрою:

1 – кільцева діафрагма;2 – конденсор;

3 – об’єкт; 4 – об’єктив; 5 – фазова пластинка

Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з правилами поведінки й техніки безпеки в мікробіологічній лабораторії.

2. Ознайомитися з правилами роботи з чистими культурами мікроорганізмів та методами їхньої мікроскопії.

3. Приготувати й провести мікроскопічне дослідження прижиттєвих препаратів мікроорганізмів:

Метод «роздавленої краплі»

На чисте знежирене предметне скло мікробіологічною петлею наносять краплю суспензії м/о. Якщо в культурі розвилося дуже багато бактерій, її розводять водою.

Покривне скло ставлять на ребро з краю краплі і поступово опускають на неї. Між стеклами не повинно залишатися пухирців повітря, які заважатимуть мікроскопії. Крапля повинна бути невеликою, щоб після «роздавлення» рідина не виступала за край покривного скла. Препарат розглядають із сухою системою.

Метод «висячої краплі»

Препарат «висяча крапля» використовують для виявлення рухливості м/о. Крім того, можна довгостроково спостерігати за життєдіяльністю м/о: розмноженням, утворенням і проростанням спор.

Для готування препарату невелику краплю суспензії м/о наносять на покривне скло, перевертають його краплею вниз і поміщають на спеціальне предметне скло з поглибленням (лункою) у центрі. Крапля повинна вільно висіти, не торкаючись країв і дна лунки. Край лунки попередньо змазують вазеліном. Крапля виявляється герметично замкненої у вологій камері, що дозволяє багатоденне спостерігання за об'єктом.

Препарати розглядають під мікроскопом, злегка затемнюючи поле зору; конденсор трохи опускають, надходження світла регулюють увігнутим дзеркалом. З невеликим збільшенням знаходять край краплі, що буде чітко видний у затемненому полі зору. Край краплі пересувають у центр полю зору мікроскопа і переводять на велике збільшення, розширивши при цьому діафрагму. Більш чіткі результати можна одержати у мікроскопії у темному полі чи у фазовому контрасті.

Препарат «відбиток»

Ці препарати є зручними для вивчення природного розташування клітин у колонії м/о й особливо для дослідження форми спор і спороносців актиноміцетів і грибів.

З агаризованої пластинки, на якій м/о виросли суцільним газоном, вирізають скальпелем невеликий блок і переносять на предметне скло так, щоб поверхня з м/о була звернена нагору. Потім до газону прикладають чисте покривне скло і негайно знімають, намагаючись не зрушити убік. Отриманий препарат поміщають відбитком униз у краплю води (можна в краплю метиленового синього) на предметне скло і розглядають під мікроскопом із сухою системою. Такий відбиток можна одержати і на предметному склі, якщо торкнутися поверхні колонії предметним склом. Відбитки можна фіксувати й забарвлювати будь-яким способом.

4. Приготувати для мікроскопічного дослідження препарати фіксованих і забарвлених кліток мікроорганізмів простим способом.

Дослідження фіксованих забарвленихпрепаратів – найбільш розповсюджений мікробіологічний метод для виявлення морфологічних особливостей, кількісного обліку м/о, а також для перевірки чистоти культури. Фіксовані забарвлені препарати можуть зберігатися тривалий час і розглядаються з імерсією. Їх приготування включає наступні етапи: виконання мазка, висушування, фіксацію й забарвлення.

У простому забарвленні м/о застосовують якийсь один з основних анілінових барвників: метиленовий синій, основний фуксин, генціановий фіолетовий, кристалічний фіолетовий. Профарбовується вся клітина.

Готування мазка

За допомогою стерильної бактеріологічної петлі чи піпетки нанести на знежирене предметне скло краплю суспензії мікроорганізмів.

Матеріал із густого живильного середовища узяти бактеріологічною петлею і внести його в краплю стерильної водопровідної води. Матеріал рівномірно тонким шаром розподілити на площі 1-2 см².

Висушування мазка

Висушити приготовлений мазок при кімнатній температурі у повітрі. Тонкий мазок висихає дуже швидко. Якщо висушування мазка уповільнене, препарат можна злегка нагріти в струмені теплого повітря, тримаючи предметне скло високо над полум'ям пальника мазком нагору. Цю операцію виконують дуже обережно, не перегріваючи мазка, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.

Фіксація

Фіксація переслідує кілька цілей: забезпечити прикріплення кліток до скла; зробити мазок більш сприйнятливим до забарвлення, оскільки мертві клітини забарвлюються краще, ніж живі; зробити безпечним подальші маніпуляції з мазком, що важливо в роботі з патогенними мікроорганізмами. Найпростіший і розповсюджений спосіб фіксації – термічне оброблення. Після висушування мазок зафіксувати в полум'ї пальника. Тримаючи скло мазком нагору, тричі провести його через гарячу частину полум'я пальника. Щоб уникнути перегрівання, час прямого впливу полум'я не повинний перевищувати 3-4 с. Крім жару фіксацію можна робити хімічними речовинами, для цього використовують 96%-ний етиловий спирт (час фіксації 5-10 хвилин), суміш Нікіфорова (спирт: ефір – 1:1; час фіксації 10-15 хвилин); ацетон (5 хвилин) та ін.

Забарвлення

Фіксований препарат помістити мазком нагору на місток із двох паралельних скляних паличок, з'єднаних гумовими трубками, що знаходяться на стінках кювети чи кристалізатора. Нанести на нього 2-3 краплі барвника (кінець піпетки не повинний торкатися мазка!) на 2-3 хв. Під час фарбування розчин барвника на мазку не повинний підсихати, при необхідності доливати нові порції. Для одержання більш чистих препаратів барвник наливають на мазок, покритий фільтрувальним папером. По закінченні фарбування препарат промивають водою доки, поки стікаюча вода не стане безбарвною. Потім препарат висушують у повітрі і промокають фільтрувальним папером.

5. Виконати мікроскопію з імерсією фіксованого та забарвленого препарату мікроорганізму.

Правила роботи з імерсійним об'єктивом.

Після установлення освітлення приготовлений сухий пофарбований препарат спочатку розглядають із невеликим збільшенням під об'єктивом сухої системи (8х, 40х). Знайшовши найбільш вдале місце на ньому, препарат закріплюють затисками на столику мікроскопа. Тубус мікроскопа піднімають і, повертаючи револьвер, установлюють імерсійний об'єктив. Потім у центр препарату на мазок, не знімаючи зі столика мікроскопа, наносять краплю імерсійної (кедрової) олії і, дивлячись збоку, обережно опускають тубус мікроскопа до занурення об'єктива в олію. Стежать за тим, щоб фронтальна лінза не торкнулася предметного скла і не одержала ушкодження. Після цього, дивлячись в окуляр, макрометричним гвинтом повільно піднімають об'єктив до появи в полі зору досліджуваного об'єкта. Фокус уточнюють за допомогою мікрометричного гвинта.

Після роботи кедрову олію негайно видаляють з об'єктива серветкою, що змочена очищеним бензином. Ксилол і спирт використовувати не рекомендується, тому що вони можуть викликати розклеювання лінз об'єктивів.

У правильно забарвленому і добре промитому препараті поле зору залишається світлим і чистим, а пофарбованими залишаються клітини мікроорганізмів.

6. Вивчити препарати. Результати занести до протоколу у вигляді рисунка. Зробити висновки.

7. Препарати, перш ніж вимити, поміщають у судину з дезинфікуючим розчином.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: