Секвенирование (сиквенс) геномов и фрагментов ДНК.

Грубо говоря, сиквенс - это результат секвенирования ДНК либо РНК. Техника секвенирования совершенствуется уже более 30 лет, начиная с 70х, когда пользовались радиоактивной меткой (и на секвенирование даже коротких фрагментов уходили недели), вплоть до перспективных методов последних лет, дозволяющих читать миллионы оснований за очень короткое время.

"Классическая" последовательность манипуляций заключается в постановке ПЦР (полимеразной цепной реакции) и последующем чтении ДНК на секвенаторе. ПЦР во многом аналогична естественному процессу репликации ДНК, с той разницей, что продуктом реакции является новая одинарная цепь вместо двойной. Перед началом реакции с помощью нагревания добиваются денатурации - расплетания цепей исходного образца ДНК. Как и естественная репликация, рост цепи при ПЦР начинается с праймера - короткого, но вместе с тем уникального, заранее синтезированного, фрагмента каждой цепи на ее 5'-ом конце, который станет началом новой цепи, растущей в направлении 3'-го конца. Для реакции используются специальные термостойкие полимеразы, способные сохранить активность при повышенной температуре. Целью ПЦР является увеличение количества ДНК в миллионы раз, чего добиваются многократным повторением циклов, каждый из которых дает увеличение количества в два раза. С учетом того, что следующим этапом будет секвенирование, в состав нуклеотидов, из которых строятся новые цепочки, подмешивается определенное количество т.н. "терминаторов" - модифицированных молекул, к 3'-му концу которых не способны присоединяться новые. При этом каждый такой нуклеотид метится особым флуоресцентным красителем, чтобы при возбуждении лазером детектор мог легко распознать основание (A, G, T, C) по длине волны. Готовый ПЦР-продукт разгоняется в геле, как при электрофорезе, и, двигаясь по тонкому капилляру, проходит зону сканирования, где луч лазера улавливается детектором, передающим тип прочтенного основания управляющему компьютеру. Правильный порядок "чтения" гарантируется тем, что чем короче фрагмент, т.е. чем ближе к 5'-му концу исходного продукта вместо нормального нуклеотида присоединился терминатор, тем быстрее фрагмент "добежит" до сканера.

Описанная классическая схема позволяет читать лишь относительно короткие фрагменты ДНК - порядка 1-2 kbp, и до недавнего времени она была единственно доступной. Также оговоримся, что здесь мы ограничились только описанием процедуры, использующей специфические праймеры, то есть перед тем, как ставить ПЦР и секвенировать некоторый фрагмент, нужно неплохо знать, как выглядят его концы. Есть и более универсальные методы, применяемые при тотальном секвенировании больших участков генома, их мы здесь касаться не будем. Заметим только, что "специфичность" праймера отнюдь не значит, что реакция пройдет только в том случае, если в геноме найдется участок, полностью комплементарный последовательности прайиера. Праймеры намеренно синтезируют таким образом, чтобы они могли присоединяться и к мутировавшим участкам; такие праймеры, обычно подходящие для всех индивидов в пределах вида, называют "консенсусными".

Прочитанная последовательность ДНК, ограниченная двумя праймерами, называется сиквенсом. Как мы уже заметили в предыдущем разделе, отвлекаясь от химической структуры, с математической точки зрения подобные цепочки можно рассматривать как последовательности букв A, G, T и C, снабженные ориентацией, обычно от 5' к 3'. Существует масса способов хранения таких последовательностей в электронном виде, начиная от простой строки и заканчивая сложными форматами, где фрагменты нуклеотидного "текста" дополняются различными аннотациями для разъяснения его биологического "смысла", если таковой известен.

Наиболее крупным онлайн-хранилищем сиквенсов является Генбанк, откуда любой сиквенс можно экспортировать во множестве форматов, включая FASTA.

К сожалению, иногда встречаются случаи, когда даже современное оборудование по каким-либо причинам не в состоянии прочитать тот или иной нуклеотид в последовательности, возвращая результат вроде "A или G" или даже "A, G, T или С". Вспомним также, что в одном из предыдущих разделов мы говорили о гетероплазмии в мтДНК, то есть одновременном присутствии в геноме нескольких вариантов нуклеотидов в одной и той же позиции. Во время ПЦР и секвенирования будут размножены и прочитаны практически все виды цепочек, ограниченных выбранными праймерами, поэтому даже идеальное оборудование может (и должно) вернуть результат неопределенного вида.

Можно сказать, что использование праймеров является естественной "химической" формой адресации внутри генома. Так, вместо "25-ая позиция такого-то участка такой-то хромосомы" с практической точки зрения удобнее указать последовательность в непосредственной близости от искомой точки, достаточно длинную, чтобы быть уникальной во всем геноме данного вида, и достаточно "гибкую", чтобы благодаря использованию расширенного алфавита IUPAC покрывать все эволюционные формы рассматриваемого участка у вида, и затем "адресовать" искомую точку, отсчитав от конца последовательности, например 3'-го, определенное число позиций.

27.В-лимфоциты, антитела и антигены: Их роль в гибридомной технологии.

Долгое время единственным источником монАТ были опухолевые линии антитело продуцирующих клеток миеломы и плазмацитомы, выделенные из больных людей и животных. Такие клетки могли быть адаптированы к росту в культуральных средах и секретировать моноклональные антитела, но было очень трудно и зачастую даже невозможно определить антиген, к которому эти антитела были направлены. Понятно, что использование таких монАТ было очень ограничено. Ситуация кардинально изменилась в 1975 году, когда ученые Георг Жан Франц Кёлер (1946-1995) и Сезар Мильштейн (1927-2002) предложили метод получения моноклональных антител предопределенной специфичности, за что позднее были удостоены Нобелевской премии.

Смысл гибридомной технологии заключается в создании гибридной клетки (получившей название «гибридома»), получаемой путем слияния антитело- продуцирующего В-лимфоцита и опухолевой клетки миеломного или плазмацитомного ряд. Такая гибридома обладает свойством секретировать антитела, взятой у В-лимфоцита, и способностью к бесконечному делению, взятой у опухолевой клетки.

Источником В-лимфоцитов для получения гибридомы служат лимфоидные органы животного, гипериммунизированного тем антигеном, против которого хотят получить монАТ. Гипериммунизация сильно повышает процентное содержание В-лимфоцитов, продуцирующих антитела желаемой специфичности, в общей популяции клеток лимфоидного органа. Лимфоциты, выделенные из тканей селезенки, лимфоузлов, периферической крови, не способны к самостоятельному делению и живут в культуре всего 10-14 дней. Миеломные клетки, напротив, могут жить и делиться в культуре сколь угодно долго, но не продуцируют антитела нужной специфичности (чаще используют линии миелом или плазмацитом, вообще не продуцирующие никаких антител).

В результате процедуры гибридизации (слияния) образуется гетерогенная популяция клеток, состоящая, во-первых, из неслившихся клеток лимфоидного органа; во-вторых, из неслившихся клеток миеломы; в-третьих, из гибридов лимфоцит+лимфоцит и миелома+миелома; в четвертых, из гибридов лимфоцит+миелома, из которых лишь часть (часто весьма небольшая) стабильно продуцирует антитела нужной специфичности. Понятно, что необходимо отделить интересующие клетки от всех остальных. От неслившихся лимфоцитов и гибридов лимфоцит+лимфоцит избавляться не нужно: через несколько дней они умрут сами; от неслившихся опухолевых клеток и гибридов миелома+ миелома избавляются с помощью селективных сред (подробности ниже); среди оставшихся клеток (гибридов лимфоцит+миелома) отбирают нужные путем клонирования, когда из одной клетки выращивают популяцию клеток (клеточный клон) и отбирают среди таких клонов лишь те, которые стабильно продуцируют антитела требуемой специфичности.

Секрецию антител определяют различными методами скрининга супернатантов гибридом, другими словами, проводят анализ той культуральной среды, в которой рос конкретный клон. Далее антитела выделяют из культуральной или асцитной жидкости и проводят более детальные исследования на предмет их пригодности для использования в тех целях, для которых монАТ были получены. Клетки-продуценты можно заморозить и хранить в жидком азоте долгое время.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: