Визначення концентрації Іg А, М, G.

Для кількісного визначення імуноглобулінів в сироватці крові та інших біологічних рідинах людини використовують твердофазний метод імуноферментного аналізу (ІФА).

Прямий твердофазний метод ІФА заснований на принципі „сендвіча". Аналіз проводиться в дві стадії.

На першій стадії контрольні зразки з відомою концентрацією імуноглобулінів (А, М, G) і досліджувані проби інкубуються в лунках полістіролового планшета з іммобілізованими моноклональними антитілами (МКАТ) до імуноглобулінів (A, M, G). Потім планшет “відмивається” (для видалення із системи інших, неспецифічно зв`язаних з моноклональними антитілами компонентів).

На другій стадії імуноглобулін (А, М, G), що зв'язався в лунках, обробляють кон'югатом МКАТ до Іg (А, М, G) людини з пероксидазою (МКАТ у складі кон'югату та іммобілізовані в лунках планшета МКАТ специфічні до різних ділянок молекули Іg (А, М, G).

Після „відмивання" надлишку кон'югата імунні комплекси „іммобілізовані МКАТ -1g (А, М, G) - кон'югат" виявляють ферментативною реакцією пероксидази з перекисом водню в присутності хромогену. Інтенсивність забарвлення хромогену пропорційна концентрації Іg (А, М, G) в досліджуваному зразку. Після зупинки пероксидазної реакції стоп-реагентом результати реєструють фотометрією зразків (вимірюють оптичну густину в лунках планшета при 492 нм).

1 - МКАТ до Іg (А,М,G), іммобілізовані в лунках планшета;

2 - Іg (А,М,G) досліджуваних зразків;

3 - кон’югат (МКАТ до Іg (А,М,G) з ферментною міткою.

Конкурентний твердофазний метод ІФА.

В лунки полістиролового планшета з іммобілізованими імуноглобулінами людини (ІgA – 1-4 ряди, IgM – 5-8 ряди, ІgG – 9 –12 ряди) вносять контрольні сироватки (“кс”) з відомою концентрацією Іg (А, М, G), досліджувані зразки (14) та фосфатно-сольовий буфер (“б”, використовується для розведення зразків, контролів, кон`югатів, промивання планшета). Безпосередньо після цього в лунки вносять відповідні розчини кон`югатів (кон`югат А).

(МКАТ до ІgА з ферментною міткою – пероксидазою) – в 1-4 ряди, кон`югат М – в 5-8 ряди, кон`югат G в 9-12 ряди). Імуноглобуліни, що містяться в досліджуваних зразках, конкурують з іммобілізованими на твердій фазі імуглобулінами за зв`язок з кон`югатом. Ступінь зв`язування введених МКАТ з імуноглобулінами твердої фази знижується (їх “перехвачують” імуноглобуліни досліджуваних зразків). Після інкубації планшет промивають. Зв`язок МКАТ у складі кон`югату з іммобілізованими імуноглобулінами оцінюють за допомогою ферментативної реакції пероксидази з перекисом водню в присутності хромогену. Для цього в лунки вносять субстратну суміш (субстрат – Н₂О₂ та хромоген) і знову інкубують. Після зупинки стоп-реагентом ферментативної реакції результати реєструють фотометрією зразків.

1 - іммобілізовані в лунках планшета імуноглобуліни (А,М,G);

2 - МКАТ до Ig (А,М,G) з ферментною міткою;

3 - імуноглобуліни (А,М,G) досліджуваних зразків.

Концентрацію імуноглобулінів (А, М, G) в досліджуваних зразках визначають по калібровочному графіку, або використовують обернено пропорційний розрахунок:

Р_к - оптична густина контрольного зразка, Виходячи з цього:

Р_х - оптична густина досліджуваного зразка,

С_к - концентрація імуноглобуліну в контрольному зразку,

С_х - концентрація імуноглобуліну в досліджуваному зразку.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: