Хроматография на бумаге

В настоящее время этот метод в значительной мере вытеснен более совершенными методами, но его продолжают применять для разделения аминокислот. Выделяют восходящую и нисходящую хроматографии на бумаге. При восходящей хроматогафии растворитель заливают на дно хроматографической камеры, а бумагу с нанесенными на нее образцами (см. ход работы) располагают так, чтобы точки старта не были погружены в растворитель. Последний смачивает нижний конец бумаги, и фронт растворителя постепенно поднимается вверх, обеспечивая разделение анализируемых соединений. В нисходящей хроматографии растворитель заливают в специальную лодочку, помещаемую в верхней части камеры. Один из концов бумаги погружают в растворитель и закрепляют придавив, например, стеклянной палочкой, помещенной на дно лодочки. Остальная часть хроматографической бумаги свободно свисает в камере, и растворитель постепенно смачивает ее сверху вниз. Хроматографическая камера плотно закрывается для удержания паров растворителя, которые препятствуют высыханию бумаги. С этой же целью на дно камеры наливают небольшое количество растворителя для усиления испарения.

По окончании хроматографии полоску бумаги, смоченную растворителем, извлекают из камеры, высушивают и обрабатывают определенным образом, для проявления разделяемых соединений. При разделении аминокислот бумагу обрабатывают 0.5% раствором нингидрина в ацетоне с последующим прогреванием в течение нескольких минут при 90-110°С.

Для разделения аминокислот используют полярные растворители в виде бинарных, тройных и более сложных смесей воды, спиртов, кислот и оснований. Более полярные компоненты растворителя ассоциируют с целлюлозой и образуют стационарную фазу, а менее полярные составляют подвижную фазу. Поэтому разделение аминокислот на бумаге представляет собой вариант распределительной хроматографии. Аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Met) перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями (Pro, Ala, Gly) или с полярными боковыми цепями (Thr, Glu, Arg, Ser, Asp, His, Lys, Cys). Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных – в органических растворителях. Отметим, что в ряду неполярных аминокислот (Gly, Ala, Val, Leu) при увеличении длины неполярной боковой цепи, увеличивается и подвижность аминокислоты.

Отношение расстояния, на которое перемещается данная аминокислота, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя (обе величины определяют от линии старта), называют подвижностью и обозначают символом R_f. Значение R_f для каждой аминокислоты зависит от условий разделения, например, от типа растворителя. Рекомендуется одновременно с неизвестной смесью аминокислот проводить хроматографирование стандартов. В этом случае подвижности компонентов исследуемой смеси можно сравнить с подвижностями стандартов.

Для количественного определения каждое пятно вырезают и аминокислоту элюируют (вымывают) подходящим растворителем; затем после добавления нингидрина измеряют оптическую плотность раствора. В другом случае бумагу обрабатывают нингидрином и интенсивность окрашивания пятен измеряют с помощью специального фотометра (денситометра) в проходящем или отраженном свете.

При разделении смесей аминокислот часто используют двухмерную хроматографию. В этом случае смесь наносят в один из углов квадратного листа бумаги и проводят разделение в одной системе растворителей. Затем лист извлекают, высушивают, разворачивают его на 90° и хроматографируют в другом растворителе. Данный метод получил наибольшее распространение именно для разделения аминокислот, так как при одномерной хроматографии не всегда удается достичь полного разделения вследствие близких значений R_f у некоторых аминокислот.

Пептиды

Пептиды – это природные или синтетические соединения, молекулы которых построены из остатков α-аминокислот, соединённых между собой пептидными связями. В зависимости от количества остатков аминокислот и молекулярной массы различают: низкомолекулярные пептиды (состоящие из двух – десяти остатков аминокислот – ди-, три-, тетра-, пентапептиды и так далее), пептиды со средней молекулярной массой (от 500 до 5000 дальтон, так называемые «средние молекулы») и высокомолекулярные пептиды (с молекулярной массой от 5000 до 16000 дальтон). Наиболее распространены линейные пептиды, однако известны также циклические пептиды, молекулы которых могут иметь различные размеры. В природе встречаются пептиды, построенные не только из аминокислот, но содержащие также оксикислоты, длинные остатки жирных кислот и другие компоненты. Поэтому различают гомомерные пептиды, состоящие исключительно из аминокислот и гетеромерные пептиды, которые кроме аминокислот содержат также небелковые компоненты.

Пептиды широко распространены в природе. Они присутствуют во всех клеточных организмах (пептидный пул). Открытые и изученные в настоящее время пептиды можно разделить на группы по их основному физиологическому действию:

- пептиды, обладающие гормональной активностью (окситоцин, вазопрессин, рилизинг-гормоны гипоталамуса, меланоцитстимулирующий гормон, глюкагон, инсулин, и др.);

- пептиды, регулирующие процессы пищеварения (гастрин, холецистокинин, вазоинтестинальный пептид, желудочный ингибирующий пептид и др.);

- пептиды, регулирующие тонус сосудов и артериальное давление (брадикинин, калидин, ангиотензин II);

- пептиды, регулирующие аппетит (лептин, нейропептид Y, меланоцитстимулирующий гормон, β-эндорфины);

- пептиды, обладающие обезболивающим действием (энкефалины и другие опиоидные пептиды);

- пептиды, являющиеся токсичными веществами (аманитин, антибиотики, вырабатываемые некоторыми микроорганизмами);

- пептиды, участвующие в регуляции высшей нервной деятельности, в биохимических процессах, связанных с механизмами сна, обучения, памяти, возникновения чувства страха и так далее.

Однако такое деление пептидов крайне условно, так как многие из них обладают широким спектром действия.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: