Качественные реакции на пептиды и белки

⇐ Предыдущая 4 5 6 7 8910 11 12 13 Следующая ⇒

Биуретовая реакция позволяет обнаруживать в молекулах пептидов и белков пептидные связи. В щелочной среде белки, а также продукты их гидролиза – полипептиды – дают фиолетовое окрашивание с солями меди. Положительная биуретовая реакция проявляется у соединений, содержащих не менее двух пептидных групп (то есть у трипептидов, тетрапептидов и т.д.). Интенсивность окраски зависит от длины пептида и варьирует от сине-фиолетовой до красно-фиолетовой и красной.

Изучение механизма данной реакции показало, что с солями меди сходным образом взаимодействует биурет, который легко получается при нагревании мочевины:

В любом случае появление окраски связано с образованием комплексного соединения – биуретового медного комплекса, который имеет следующее строение:

Как можно видеть из приведенной выше формулы, биурет в щелочной среде претерпевает полную енолизацию по схеме:

Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди (II) и образуют комплексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота иминных групп. Аналогично организовано комплексное соединение меди с енолизированными пептидными группами любого другого полипептида:

Контрольные вопросы

1. Принцип строения аминокислот

2. Классификация аминокислот

3. Стереоизомерия аминокислот

4. Ионные формы аминокислот. Влияние рН на заряд аминокислоты

5. Кривые титрования аминокислот.

6. Химические свойства аминокислот

7. Пептидная связь. Химический и биологический способы образования пептидных связей

8. Методы качественного определения аминокислот

9. Методы количественного определения аминокислот

Литература

1. Кольман Я., Рем К.-Г., Наглядная биохимия, «Мир», М., 2000.

2. Ленинджер А., Основы биохимии, т.1, «Мир», М., 1985.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В., Биохимия человека, т. 1, «Мир», М., 1993.

4. Северин Е.С., Биохимия, «Гэотар-мед», М., 2004.

5. Степанов В.М., Молекулярная биология: структура и функции белков, под ред. Академика Спирина А.С., «Высшая школа», М., 1996.

6. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., Биологическая химия, «Высшая школа», М., 1998.

7. Горячковский А.М., Справочное пособие по клинической биохимии, «ОКФА», Одесса, 1994.

8. Чиркин А.А., Практикум по биохимии, «Новое знание», Минск, 2002.

9. Кухта В.К., Морозкина Т.С., Олецкий Э.И., Таганович А.Д., Биологическая химия, «Бином», М., 2008.

Дополнительная литература

1. Nelson D.L., Cox M.M., Lehninger Principles of Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2004.

2. Metzler D., Biochemistry, (The chemical reactions in living cells), Elsevier, Academic Press, V. 1-2, 2003-2004.

3. Berg J.M., Tymoczko J.L., Lubert Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2006.

Ход работы

Цель работы:	Обнаружение и идентификация аминокислот в водных растворах. Проведение качественных реакций на аминокислоты, пептиды и белки

Задание I	Изучить химические и хроматографические свойства аминокислот.

* Реакции аминокислот в водных растворах

1. На универсальную индикаторную бумагу пипеткой наносят по 1 капле растворов глицина, глутаминовой или аспарагиновой кислоты и аргинина.

2. Отмечают развивающуюся окраску индикатора во всех трех случаях и делают заключение о реакции среды.

3. Записывают уравнения реакций, описывающих поведение данных аминокислот в водных растворах.

* Взаимодействие аминокислот с сахарами

1. В две пробирки вносят по 2 мл 5% раствора фруктозы в 2.5% растворе борной кислоты.

2. В первую пробирку добавляют 2 мл 3% раствора аргинина, а во вторую – 2 мл дистил-лированной воды.

3. В третью пробирку вносят 2 мл 3% раствора аргинина и 2 мл 2.5% раствора борной кислоты.

4. Все три пробирки инкубируют в течение 5 мин в кипящей водяной бане.

5. Отмечают различие во времени появления окраски и ее интенсивности в каждой из проб.

* Разделение смеси аминокислот методом хроматографии на бумаге.

1. На полосе хроматографической бумаги отмечают линию старта (1-1.5 см от края бумаги), а также места нанесения стандартных растворов аминокислот и анализируемой смеси.

2. Микропипеткой наносят на хроматографическую бумагу по 20 мкл раствора каждой аминокислоты. Нанесение проводят в несколько приемов, следя за тем, чтобы пятно раствора не растекалось более чем на 3 мм. Каждую последующую порцию раствора наносят после полного высыхания предыдущей, что определяют по исчезновению просвечивания бумаги в точке нанесения.

3. Точки старта высушивают.

4. Параллельно готовят 20 мл растворителя, состоящего из н-бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 12:3:5. К растворителю добавляют несколько кристаллов нингидрина для окрашивания хроматограммы во время проявления.

5. Растворитель заливают в хроматографическую камеру, герметично закрывают и оставляют на некоторое время для насыщения парами.

6. Бумажную полоску помещают в хроматографическую камеру. Проявление заканчивают когда фронт растворителя переместится к противоположному концу полоски (2-3 см от края).

7. Хроматограмму высушивают.

8. Определяют значения R_f аминокислот. Идентифицируют аминокислоты, содержащиеся в анализируемой смеси.

Задание II Изучение методов идентификации индивидуальных аминокислот в растворах по качественным реакциям

* Приготовление 1% раствора белка для проведения качественных реакций

1. Отделяют белок куриного яйца от желтка, считая, что масса белка в одном яйце в среднем составляет 30г, а его концентрация ~10%.

2. Белок помещают в мерный цилиндр и добавляют девятикратный объем дистиллированной воды.

3. Полученный раствор тщательно перемешивают и фильтруют через нейлоновое сито.

* Нингидриновая реакция

1. В четыре пробирки наливают 2 мл 1% раствора белка, 2 мл 0.01% раствора глицина, 2 мл 0.01% раствора b-аланина и 2 мл воды, соответственно.

2. Во все пробирки добавляют по 10 капель 0,1% раствора нингидрина.

3. Растворы перемешивают и оставляют в водяной бане при 70˚С на 5 минут.

4. Отмечают появление окраски в некоторых пробирках.

* Ксантопреновая реакция

1. В четыре пробирки наливают 1 мл 1% раствора белка, 1 мл 0.01% раствора триптофана, 1 мл 1% раствора желатина и 1 мл воды соответственно.

2. Во все пробирки добавляют по 5-6 капель концентрированной азотной кислоты и осторожно нагревают.

3. После охлаждения в пробирки осторожно (по стенке) приливают избыток 10% раствора NaOH.

4. Отмечают появление окраски в некоторых пробирках.

* Реакция Фоля

1. В три пробирки наливают 2 мл 1% раствора белка, 2 мл 0.02% раствора цистеина и 2 мл 1% раствора желатина, соответственно.

2. Во все пробирки добавляют по 1 мл 10% раствора NaOH.

3. Пробирки осторожно нагревают до кипения, кипятят в течение 2 мин.

4. Далее в каждую пробирку добавляют по 3 капли раствора Pb(CH₃COO)₂.

5. Отмечают появление окраски в некоторых пробирках.

* Качественные реакции на триптофан

⇐ Предыдущая 4 5 6 7 8910 11 12 13 Следующая ⇒

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

vikidalka.ru - 2015-2024 год. Все права принадлежат их авторам! Нарушение авторских прав | Нарушение персональных данных