Реакция с 5-(оксиметил)фурфуролом (реакция Шульце-Распайля)

⇐ Предыдущая 5 6 7 8 91011 12 13 14 Следующая ⇒

1. В первую пробирку наливают 1 мл 0.01% раствора триптофана, во вторую – 1 мл 1% раствора белка.

2. В обе пробирки добавляют по 4 капли сахарозы.

3. Затем осторожно по стенке пробирки наслаивают в каждую по 1 мл H₂SO_{4 (конц.)}, следя, чтобы жидкости не перемешивалась.

4. Через некоторое время наблюдают окраску растворов на границе соприкосновения жидкостей.

* Качественная реакция на пролин (нингидриновая реакция)

1. В пробирку к 3 мл 0.01% раствора пролина добавляют 5 капель 1% раствора нингидрина в 95% ацетоне.

2. Содержимое пробирки перемешивают и нагревают на водяной бане при 70°С в течение 5 мин.

3. Отмечают появление окраски и ее отличие от типичной окраски нингидриновой реакции.

* Качественная реакция на тирозин (реакция Миллона)

1. В пробирку к нескольким кристаллам тирозина добавляют 5 мл 2.5% раствора серной кислоты и перемешивают до полного растворения.

2. Приливают 1 мл реактива Миллона, встряхивают и оставляют при комнатной температуре (для ускорения реакции раствор можно слегка прогреть).

3. Отмечают появление окраски.

* Качественная реакция на аргинин (реакция Сакагучи)

1. В пробирку наливают 2 мл 0.01% раствора аргинина, добавляют 2 мл 10% раствора NaOH и 5 капель 0.2% спиртового раствора a-нафтола.

2. Содержимое пробирки хорошо перемешивают, приливают 0.5 мл раствора гипобромита (NaBrO) и вновь перемешивают.

3. Немедленно добавляют 1 мл 40% раствора мочевины (для стабилизации окраски).

4. Отмечают появление окраски.

* Качественная ракция на гистидин (реакция Паули)

1. К 1 мл 1% раствора сульфаниловой кислоты в 5% растворе соляной кислоты добавляют 2 мл 0.5% раствора нитрита калия (натрия).

2. Пробирку сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 2 мл 0.01% раствора гистидина

3. Затем после перемешивания содержимого пробирки приливают 6 мл 10% раствора карбоната натрия.

4. Отмечают появление окраски.

* Качественная реакция на метионин (по Мак-Карти и Салливану)

1. К 5 мл 0.02% раствора метионина прибавляют (при помешивании) сначала 1 мл 14.3М раствора NaOH, а затем 0.3 мл 10% раствора нитропруссида Na.

2. Смесь нагревают в течение 10 мин на водяной бане при температуре 35-40⁰С.

3. Затем смесь охлаждают 2 мин в ледяной воде и добавляют при помешивании 5 мл смеси соляной и фосфорной кислот.

4. Смесь взбалтывают 1 мин и охлаждают водой комнатной температуры в течение 10 мин.

5. Отмечают появление окраски.

* Качественная ракция на глицин (реакция Циммермана)

1. К 2 мл 0.01% раствора глицина (рН 8.0) приливают 0.5 мл водного раствора о -фталевого диальдегида.

2. Отмечают появление окраски и выпадение осадка.

Задание III Освоение методов выявления пептидных связей в белках и пептидах

* Биуретовая реакция (обнаружение в молекулах пептидов и белков пептидных связей)

1. В одну пробирку наливают 2 мл 1% раствора белка, в другую 2 мл 0.01% раствора глицина, а в третью – столько же дистиллированной воды,

2. Затем в каждую из них вносят по 2 мл 10% раствора NaOH и хорошо перемешивают.

3. Добавляют по 3 капли 2% раствора CuSO₄. Пробирки встряхивают.

4. Отмечают появление окраски, объясняют различия окрашивания.

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретический материал по лабораторной

работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы лабораторной работы.

3. Зарисовать результаты хроматографического разделения аминокислот.

4. Описать результаты выполнения качественных реакций на аминокислоты.

5. Сделать выводы.

Лабораторная работа № 2

Тема: Простые белки. Физико-химические свойства белков

Цель работы: - Изучение физико-химических свойств белков: определение изоэлектрических точек казеина и желатина - Овладение методом фракционного разделения белков высаливанием

Оборудование и материалы:

· Термостат

· Пипетки стеклянные на 1 мл и 5 мл

· Микропипетки автоматические

· Цилиндры мерные на 250 мл и 100 мл

· Колба емкостью 100 мл и 250 мл

· Пробирки стеклянные

· Штативы для пробирок

· Бумага фильтровальная

· Индикаторная бумага универсальная

· Сито нейлоновое

· Воронки стеклянные для фильтрации

Реактивы:

· Яичный белок

· Буферные растворы, рН 1.0, 3.7, 4.7, 5.7, 9.0

· Гидроксид натрия (NaOH), 10% раствор

· Хлорид натрия (NaCl), крист.

· Хлорид натрия (NaCl), насыщенный раствор

· Сульфат аммония ([NH₄]₂SO₄), крист.

· Сульфат аммония ([NH₄]₂SO₄), насыщенный раствор

· Сульфат магния (MgSO₄), крист.

· Сульфат меди (CuSO₄), 2% раствор

· Ацетат свинца (Pb(CH₃COO)₂), раствор

· Желатин, порошок, 0.5% 1% раствор

· Казеин, раствор

· Уксусная кислота (CH₃COOH), 1% раствор

· Уксусная кислота (CH₃COOH), 10% раствор

· Азотная кислота (HNO₃), конц., 5% раствор

· Серная кислота (H₂SO₄), конц.

· Соляная кислота (HCl), конц.

· Трихлоруксусная кислота (ТХУ), 5% раствор

· Спирт этиловый (C₂H₅OH), 96%

· Ацетон

· Фенол, насыщенный водный раствор

· Формалин

· Пикриновая кислота, насыщенный раствор

· Таннин, 10% раствор

· Гексацианоферрат калия (K₃[Fe(CN)₆]), 5% раствор

· Вода дистиллированная

Теоретическая часть

Белки

Белки – высокомолекулярные органические вещества, состоящие из остатков a-аминокислот, связанных между собой пептидными связями. Каждый белок характеризуется специфичной аминокислотной последовательностью и индивидуальной пространственной структурой (конформацией). Размер белка отражает его молекулярная масса, которая измеряется в дальтонах (Да) или, чаще, из-за относительно большой величины молекулы в производных единицах – килодальтонах (кДа).

Таблица 1. Молекулярная масса наиболее известных белков.

Белок	Молекулярная масса (Да)
Инсулин
Цитохром С
Рибонуклеаза А
Миоглобин
Химотрипсин
Гемоглобин
Сывороточный альбумин

По составу белки делят на простые и сложные. К простым белкам относят макромолекулы, состоящие только из аминокислот. Сложные белки включают неаминокислотные компоненты, такие как гем, производные витаминов, липиды, углеводы, атомы металлов и другие.

Простые белки

Универсальной системы классификации белков не существует, хотя имеется несколько общеупотребимых систем классификации, частично перекрывающихся между собой. Здесь мы рассмотрим основные принципы классификации белков, основанные на их растворимости, форме молекул, функциях, физических свойствах и особенностях трехмерной структуры.

Растворимость

Простые белки по растворимости в воде и солевых растворах условно подразделяются на несколько групп: протамины, гистоны, альбумины, глобулины, проламины, глютелины (таблица 2).

Таблица 2. Растворимость наиболее известных типов белков.

Виды белков	Растворимость и функция
Альбумины	Белки с относительно небольшой молекулярной массой, хорошо растворимы в воде и в слабых солевых растворах. Осаждаются нейтральными солями при 100%-м насыщении. Участвуют в поддержании осмотического давления крови, транспортируют различные вещества. Альбуми-ны присутствуют в сыворотке крови, молоке, яичном белке.
Глобулины	Нерастворимы в воде, растворяются в водных растворах солей. Осаждаются в менее концентрированных солевых растворах (уже при 50%-м насыщении). Распространенные белки, входят в состав мышечных волокон, крови, молока, составляют большую часть семян бобовых и масличных культур.
Протамины	Проявляют выраженные оснóвные свойства. Хорошо растворимы в воде и слабых кислотах. Содержатся в половых клетках и составляют основную массу белка хроматина. Как и гистоны образуют комплекс с ДНК, Принимают участие в компактизации ДНК и придают ей химическую устойчивость.
Гистоны	Имеют сравнительно низкую молекулярную массу (12-13 кДа), с преобладанием щелочных свойств. Гистоны локализованы в клеточных ядрах. Растворимы в слабых кислотах, осаждаются аммиаком и спиртом. Не имеют олигомерной организации. В условиях in vivo прочно связаны с ДНК формируя нуклеопротеидные комплексы. Регулируют степень доступности ДНК для процессов репликации и транскрипции
Проламины	Растительные белки. Содержатся в клейковине злаковых растений. Растворимы только в 70%-м спирте (это объясняется высоким содержанием пролина и неполярных аминокислот).

Строго установленных границ между отдельными классами простых белков не существует. Например, четкое разграничение между альбуминами и глобулинами невозможно, если исходить только из их растворимости в воде и солевых растворах. Поэтому глобулины дополнительно подразделяют на псевдоглобулины, легко растворимые в воде, и эуглобулины, нерастворимые в воде, в отсутствие солей.

Форма молекул

По форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные (рис. 2.1). Глобулярные белки – это белки, в молекулах которых полипептидные цепи плотно свёрнуты в компактные шарообразные структуры – глобулы (третичные структуры белка). Глобулярная структура белков обусловлена гидрофобно-гидрофильными взаимодействиями. К глобулярным белкам относятся ферменты, иммуноглобулины, некоторые гормоны белковой природы (например, инсулин) а также другие белки, выполняющие транспортные, регуляторные и вспомогательные функции.

В фибриллярных белках вытянутые полипептидные цепи расположены параллельно друг другу, образуя протяженные нити или слои. Большинство фибриллярных белков не растворяются в воде. К фибриллярным белкам относят: a-кератины – белки, входящие в состав волос, шерсти, перьев, рогов; коллаген – белок сухожилий и хрящей; фиброин – белок шёлка; актин, миозин и тубулин – внутриклеточные белки, участвующие в процессах мышечного сокращения и перемещения клеток.

Большинство фибриллярных белков обладают особым свойством – в формировании их пространственной структуры, кроме слабых взаимодействий, принимают участие и ковалентные связи непептидной природы, тогда как в глобулярных белках основной вклад в стабилизацию конформации молекулы вносят слабые нековалентные взаимодействия.

Рис. 2.1. (а) – Фибриллярный белок коллаген, (б) – Глобулярный белок миоглобин.

Функции

Белки также классифицируют в соответствии с их биологическими функциями. К наиболее важным биологическим функциям можно отнести следующие:

1) Каталитическая функция, осуществляется белками-ферментами (трансферазы, гидролазы, изомеразы, лиазы и др.). Ферменты играют важнейшую роль во всех процессах жизнедеятельности, обеспечивая протекание большинства реакций катаболизма и анаболизма клетки и всего организма в целом, а также направляя и регулируя обмен веществ.

2) Структурная функция. Структурные белки отвечают за поддержание формы и стабильности клеток и тканей. Основными структурными белками межклеточного вещества являются фибриллярные белки.

К структурным белкам относятся:

· a-кератин – в основном из кератина состоят мертвые клетки ороговевающего эпителия и их производные (волосы млекопитающих, рога, копыта, когти, перья птиц, чешуя рептилий и др.). В живых клетках эпителиальных тканей кератины образуют промежуточные филаменты;

· эластин – широко распространённый в соединительной ткани белок, особенно в коже, легких и кровеносных сосудах. В эластине большое количество аминокислотных остатков с неполярными боковыми группами, а также содержится аминокислота десмозин, являющаяся производным лизина. Данные особенности строения обусловливает высокую эластичность его волокон;

· коллаген – белок, составляющий основу соединительной ткани организма (сухожилие, кость, хрящ, дерма и др.) и обеспечивающий ее прочность и эластичность;

· белки цитоскелета.

3) Транспортная функция. Транспортные белки участвуют в переносе метаболитов, ионов, О₂ и других веществ в кровяном русле, во внеклеточных тканевых жидкостях, а также в трансмембранном переносе веществ в клетки (таблица 3)

Таблица 3. Характеристика ряда белков-переносчиков.

Белки-переносчики	Переносимое вещество
Альбумин	Жирные кислоты, билирубин, альдостерон, глутатион
Гемоглобин	Кислород, углекислый газ
Трансферрин	Железо
Церулоплазмин	Медь
Липопротеины	Липиды
Тироксинсвязывающий белок	Тироксин

4) Защитная функция. К защитным белкам относят, прежде всего, белки, участвующие в иммунной защите организма. К ним относятся иммуноглобулины, интерферон, лизоцим. К белкам, выполняющим функцию физической защиты организма можно отнести содержащиеся в плазме крови фибриноген (фибрин) и протромбин (тромбин) участвующие в процессах свертывания крови.

5) Двигательная функция присуща таким фибриллярным белкам как актин и миозин, участвующим в сокращении скелетных мышц Динеины и кинезины участвуют в энергозависимой транспортировке молекул и клеточных органелл вдоль микротрубочек. Динеины осуществляют перенос молекул и органоидов из периферических областей клетки по направлению к центросоме, кинезины действуют в противоположном направлении. Динеины также отвечают за движение ресничек и жгутиков эукариотических клеток.

6) Гормональная функция. Осуществляется такими белками, как инсулин, соматотропин (гормон роста), пролактин, тиреотропин, гонадотропин и другими.

7) Рецепторная функция. Указанная функция осуществляется белками-рецепторами, воспринимающими химические сигналы. Мембранные белки-рецепторы участвуют в трансдукции сигнала с поверхности клетки внутрь. Они регулируют функции клеток посредством изменения своей конформации в ответ на связывание сигнальной молекулы (лиганда), что приводит к активации ряда мембранных белков внутри клетки и синтезу так называемы вторичных посредников (месенджеров).

8) Регуляторная функция. Обеспечивается регуляторными белками, которые регулируют многие процессы внутри клеток (гистоны, белки-активаторы, белки-репрессоры и др.).

9) Резервная функция. В организме животных мышечные белки служат резервными питательными веществами, которые мобилизуются при крайней необходимости.

Конформация белков

Для описания пространственной организации белковых молекул используется такое понятие, как конформация. Полипептидные цепи индивидуальных белков за счет взаимодействия функциональных групп аминокислот приобретают определенную пространственную трехмерную структуру, называемую конформацией. Конформационная лабильность белков – это способность этих биополимеров к небольшим изменениям трехмерной структуры за счет разрыва одних и образования других слабых связей и взаимодействий в пределах одной молекулы.

Поскольку конформация белковой молекулы формируется при участии хотя и множества, но слабых взаимодействий различной природы, она обладает достаточной подвижностью так, что белок способен изменять ориентацию одной части молекулы относительно другой. В зависимости от условий внешней среды молекула может существовать в разных конформационных состояниях, которые легко переходят друг в друга. Энергетически выгодными для реальных условий являются только одно или несколько конформационных состояний, между которыми существует равновесие. Переходы из одного конформационного состояния в другое обеспечивают функционирование белковой молекулы. Эти обратимые конформационные переходы белков являются естественным физиологическим свойством данных биополимеров. Наиболее известной моделью, иллюстрирующей конформационные переходы в белках, является изменение состояния гемоглобина при его оксигенации/дезоксигенации.

⇐ Предыдущая 5 6 7 8 91011 12 13 14 Следующая ⇒

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

vikidalka.ru - 2015-2024 год. Все права принадлежат их авторам! Нарушение авторских прав | Нарушение персональных данных