Автоматизация анализа СОЭ

Исследование скорости оседания эритроцитов (СОЭ) является одним из самых распространенных в лабораторной практике и входит в состав общего клинического анализа крови. Этот вид анализа проводится по методу Панченкова и состоит в следующем. В капилляр общей длиной около 175 мм набирают 100 мм смеси крови с 5% раствором цитрата натрия (C₆H₅O₇Na₃ × 5H₂O) в соотношении 4:1. Цитрат натрия играет роль антикоагулянта. Капилляры с пробами крови устанавливают вертикально в штатив (рис. 1.17). При этом начинается оседание эритроцитов: сверху появляется светлая прозрачная область плазмы, а снизу – область, занятая эритроцитами. Величиной СОЭ называется глубина оседания эритроцитов по прошествии 1 часа.

Нормой считается СОЭ в диапазоне: у мужчин 1 – 10 мм/час, у женщин 2 – 15 мм/час. Увеличение СОЭ наблюдается при различных воспалительных процессах, интоксикациях, острых и хронических инфекциях, при инфаркте миокарда.

Особенно выраженное увеличение СОЭ (60 – 80 мм/час) наблюдается при онкологических заболеваниях, туберкулезе, циррозе печени.

Как известно, процесс седиментации (оседания) частиц в «ньютоновской» жидкости описывается уравнением Стокса

, (1.4)

где S₀ – коэффициент седиментации: ; r – радиус частицы; r _ч и r _ж – плотности частицы и жидкости; h ₀ – вязкость жидкости.

Кровь не является «ньютоновской» жидкостью: эритроциты склеиваются в агломерации («монетарные» столбики), которые испытывают взаимное трение; по мере оседания оно увеличивается. Кроме того, уравнение (1.4) справедливо для бесконечной среды, а у капилляра есть «дно». Все эти обстоятельства можно учесть, введя переменную вязкость. Ее приближенно можно аппроксимировать полиномом[1] , (1.5)

где а» 8, Н – гематокрит в области, занимаемой эритроцитами. Напомним, что гематокритом называется отношение объема форменных элементов к объему плазмы. В большинстве случаев объем форменных элементов практически равен объему эритроцитов. Нетрудно показать, что гематокрит на границе раздела зоны чистой плазмы и зоны эритроцитов определяется формулой

, (1.6)

где x_n = x/l_p – нормированная глубина седиментации, l_p – рабочая длина капилляра (100 мм). С учетом выражений (1.4) – (1.6) получаем дифференциальное уравнение

, (1.7)

где ; h _0n = 3,3 – нормированный начальный коэффициент вязкости; ; S ₀ – равновесный (начальный) коэффициент седиментации. Решая уравнение (1.7), получим формулу глубины оседания эритроцитов в неявном виде

(t – в час). (1.8)

При t ® ¥ левая часть равенства (1.8) стремится к бесконечности за счет третьего слагаемого в скобках; при этом , а x _n стремится к предельной глубине x _nпред = 1/ b ₂ = 1/(1+ H ₀).

Как отмечают практики, помимо конечного значения СОЭ важную информацию несет также его динамика, т.е. приращения глубины за некоторые равные интервалы времени (5 мин.) в течение часа. Например, по характеру динамики выявляются ранние стадии туберкулеза: в течение первых двадцати минут оседание эритроцитов идет быстрее. Однако кропотливая работа, связанная с большим количеством отсчетов, не приемлема для лаборантов. Врачи признают, что даже при регистрации обычной СОЭ бывают ошибки: неправильно записывают результат, перепутывают фамилии пациентов. Поэтому для больших поликлиник и больниц актуальной является автоматизация измерения и регистрации СОЭ. Для традиционного метода (Панченкова) эта задача была решена кафедрой биохимии МГУ им. Ломоносова. Сущность разработанного ею аппарата заключается в следующем. В штатив Панченкова устанавливаются 10 капилляров с кровью, которые сканируются приспособленным для этих целей обычным сканером. Информация о глубине оседания эритроцитов вводится в компьютер. Процесс оседания наглядно отображается на экране монитора. Время исследования может устанавливаться произвольным, в том числе и больше 1 часа.

Некоторым недостатком метода Панченкова является длительное время исследования (1 час). Кроме того, существуют методы тестирования лекарственных препаратов на аллергичность, основанные на седиментации эритроцитов. Эти методы требуют еще большего времени исследования – до трех часов. Поэтому была предпринята попытка (кафедра биомедицинской электроники ХНУРЭ и НИИ дерматологии и венерологии) создать аппарат для экспресс-анализа СОЭ, основанный на принципе центробежной седиментации эритроцитов.

Рассмотрим сущность этого метода. Капилляры с кровью устанавливаются в пазы ротора центрифуги, который приводится во вращение (рис. 1.19). Диск ротора 1 установлен вертикально. В пазы, профрезерованные в диске, устанавливаются капилляры 2 с кровью (на самом деле их пятнадцать). Капилляры закрываются крышкой 3. Для съема информации (считывания глубины оседания эритроцитов) используется фотоэлектрическая система, состоящая из источника света 4 и фотоприемников 5. Свет от источника проходит через коллимирующие щели 6 в крышке и диске. Слева от капилляров (по направлению вращения) имеются

При вращении диска на частицы действует переменное ускорение: в верхнем положении капилляра а = а _ц – g, а в нижнем а = а _ц + g, где а _ц – центростремительное ускорение а _ц = w ² r. Под действием этого ускорения возникает центробежная сила, которая перемещает эритроциты. Свет от источника проходит через осветленную область (плазму) капилляра и попадает на фотоприемники. Чем больше осветленная область, тем больше фотоприемников будет освещено. Сигналы с фотоприемников поступают в устройство сбора и обработки информации.

Необходимо выбрать размер (радиус) диска и частоту вращения такими, чтобы а _ц было намного больше g. Например, при частоте вращения диска 600 об/мин и среднем радиусе диска 0,1 м а _ц» 400 м/c², что примерно в 40 раз больше g. Поэтому следует ожидать сокращения времени исследования по сравнению с традиционным методом в 40 раз.

Движение частиц в «ньютоновской» жидкости при центробежной седиментации подчиняется уравнению

.

Решение этого уравнения будет иметь вид

или , (1.9)

где r ₀ – начальное расстояние частицы от центра вращения. Как видим из (1.9), движение частиц будет нелинейным во времени.

С учетом изменения вязкости крови вид решения будет намного сложнее:

, (1.10)

где x_n = (r – r ₀) /l _p, x _{0 n} = r ₀/ l _p. Если вязкость неизменна, то b ₁ = 0 и уравнение (1.10) обращается в (1.9). Исследования уравнения (1.9) показывают, что, изменяя рабочую длину капилляра l _p, можно подобрать ее так, чтобы кривая седиментации была самой близкой к кривой седиментации в поле тяготения (с учетом масштаба времени). На практике подбирают параметры диска (радиус и частоту вращения) так, чтобы получить такую же «глубину» оседания эритроцитов, как и в традиционном методе. Если используются стандартные капилляры длиной около 175 мм, то габариты диска получаются солидными – диаметр около 400 мм.

Наиболее ответственным узлом аппарата для экспресс-анализа СОЭ является измерительный блок. И здесь нет иной альтернативы фотоэлектрическому методу считывания. Наиболее простой вариант этого блока – линейный источник света и линейка фотодиодов. Учитывая, что на практике возможна СОЭ 80 мм/час, и задаваясь точностью измерения ± 2 мм, приходим к выводу, что необходима линейка из 40 фотодиодов. Информация, поступающая от фотоприемников, должна временно (от капилляра до капилляра) храниться в буферном регистре. Кроме того, желательно обойтись без импульсных усилителей сигналов фотоприемников. В противном случае увеличиваются аппаратные затраты. Эта задача решается построением буферного регистра на RS-триггерах КМОП. На рис. 1.20 показана схема сопряжения фотодиодных приемников с микросхемой К561ТР2 (КМОП). Эта микросхема содержит четыре RS-триггера с тремя состояниями по выходу. Управление состояниями триггера осуществляется по входу Е (enable). При низком уровне сигнала на этом входе выходы триггеров находятся в высокоимпедансном состоянии. Все триггеры имеют общий вход сброса

Фотодиоды включены по фотодиодной схеме. При освещении фотодиода светом его ток увеличивается и на нагрузочном резисторе появляется высокое напряжение, переключающее RS-триггер в единичное состояние. Так как входное сопротивление КМОП микросхемы очень большое, сопротивление нагрузки можно брать также большим (сотни кОм). Тогда можно получать высокие уровни сигнала при не очень большой интенсивности источника света. Однако необходимо следить за тем, чтобы падение напряжения, создаваемое на нагрузочном резисторе было существенно меньше порога переключения триггера U_пор» U_пит/2 =7,5 В. Темновой ток фотодиодов обычно не превышает 2 мкА. Поэтому максимальное сопротивление нагрузки может быть равно 1 МОм.

Таким образом, в нашем случае для построения буферного регистра потребуется 10 микросхем К561ТР2. Так как измерительная информация будет обрабатываться микропроцессорным устройством или ЭВМ, то для обмена информацией используется обычно 8-разрядная шина. Это значит, что массив из 40 бит должен считываться по частям. Поэтому RS-триггеры объединяются в группы по восемь (пять групп) и каждая группа управляется отдельным входом разрешения Е. Как будет ясно из дальнейшего, наиболее целесообразно осуществлять управление установкой от ЭВМ.

Упрощенная структурная схема аппарата для экспресс-анализа СОЭ показана на рис. 1.21. Управление аппаратным блоком и ввод информации в ПЭВМ осуществляется через параллельный программируемый интерфейс ППИ (например, КР580ВВ55). Эта микросхема имеет три порта А, В, С, порт ввода-вывода Q и входы управляющих команд УК. В самом начале работы производится программирование режима работы ППИ. Затем подается команда «Пуск», которая через порт С включает RS-триггер и реле, управляющее приводом и источником света. Информация с буферного регистра вводится в ЭВМ через порт А побайтно от пяти групп по 8 триггеров. Для управления вводом используется дешифратор ДШ, который активизирует входы Е соответствующих групп триггеров. Для идентификации капилляров используются сквозные отверстия в диске (см. рис. 1.19): у последнего капилляра – 2, а у остальных – по одному отверстию. Пара отверстий служит для фиксации конца оборота. Для формирования сигналов идентификации используются дополнительно 2 фотодиода. Сигналы от них через логическую схему ЛС поступают на часть порта С ППИ, запрограммированную на ввод.

На монитор выводятся служебные сообщения, наглядная информация о процессе оседания в виде имитации капилляров с кровью. В них область, занимаемая плазмой, закрашивается желтым цветом, а область, занимаемая эритроцитами, – красным. В конце исследования могут быть построены графики седиментации эритроцитов для всех капилляров или выборочно.

Здесь «единица» соответствует освещенному фотодиоду, а «ноль» – неосвещенному. Как видно из рисунка, в зоне плазмы могут быть «нули», а в зоне эритроцитов – «единицы», которые могут рассматриваться как артефакты (помехи). В зоне границы раздела на довольно большом протяжении «единицы» могут чередоваться с «нулями». Для установления границы нужен специальный алгоритм. Наиболее простой – алгоритм «рамки». Рамка, в которую входит часть массива, например 5 бит, последовательно перемещается вдоль массива до тех пор, пока число единиц в ней не станет меньше определенной величины (например, двух). При этом сканирование массива прекращается и по левому концу рамки устанавливается граница раздела. Могут применяться и другие, более сложные, алгоритмы. Однако надо следить за тем, чтобы алгоритм успевал произвести поиск границы за время смены капилляров (5 – 7 мс).

Кроме экспресс-анализа СОЭ рассмотренный аппарат может выполнять экспресс-анализы лекарственных препаратов на аллергичность. Он заключается в следующем. В пробы с кровью добавляются тестируемые лекарственные препараты. Имеется также контрольная проба: кровь, разбавленная физраствором в соотношении 1:1. Пробы заправляются в капилляры и центрифугируются в течение 12 минут. Строятся графики седиментации эритроцитов. Если конечные результаты в тестируемых пробах отличаются на ± 20% от глубины седиментации в контрольной пробе, то соответствующие лекарственные препараты считаются сенсибилизирующими (аллергичными) с вероятностью 80%. При седиментации в поле тяготения исследование занимает 3 часа.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: