Приборы для фотометрического анализа

Как отмечалось выше, фотометрические приборы можно разделить на два типа: узкоспециализированные и универсальные. В качестве прибора первого типа рассмотрим гемоглобинометр ГФЦ-4. Хотя определение гемоглобина относится к анализам, проводимым в клинической лаборатории, по соображениям единства методики его описание приведено в этом разделе. Этот прибор был разработан ввиду большого объема анализов гемоглобина в клинической лаборатории. Он представляет собой однолучевой фотометр, дающий непосредственный отсчет гемоглобина в г/л.

В качестве унифицированного метода измерения гемоглобина у нас принят гемиглобинцианидный метод. Проба крови объемом 20 мкл разводится в трансформирующем растворе, который приготовляется на дистиллированной воде из двууглекислого натрия, ацетонциангидрина и железосинеродистого калия (красная кровяная соль). Этот раствор имеет наибольшую оптическую плотность для зеленого света. В трансформирующем растворе эритроциты растворяются, выделяя гемоглобин, который, соединяясь с раствором, образует гемиглобинцианид. Норма гемоглобина составляет: у мужчин 132 – 164 г/л, у женщин 115 –145 г/л.

Структурная схема прибора приведена на рис. 2.21. Он состоит из генератора импульсов стабильной амплитуды ГИ, питающего светодиод, фотометрического блока ФМБ, усилителя У, логарифмического преобразователя ЛП и индикатора ИНД. В фотометрический блок входят светодиод зеленого свечения типа АЛ307ГМ, фотодиод ФД23К, кювета К и преобразователь ток-напряжение ПТН (см. рис. 2.16).

Светодиод работает в режиме кратковременных вспышек с большой силой света длительностью 10 мс и периодом 1 с, т.е. скважностью Q = 100. При этом средний ток равен I _cp = I _m/ Q = 0,01 I _m. При допустимом среднем токе светодиода 20 мА амплитуда тока может достигать 2А. На практике она составляет сотни мА. Тем самым удается получить достаточно большой сигнал на выходе фотометрического блока. Логарифмический преобразователь выполнен по схеме рис. 2.18. Установка нуля осуществляется регулированием величины U _оп, а калибровка – регулированием коэффициента усиления усилителя У.

Важнейшим требованием, предъявляемым к источнику света, является стабильность интенсивности. Для этого стабилизируют амплитуду тока, питающего светодиод. Схема генератора импульсов приведена на рис. 2.22. Задающий генератор собран по схеме несимметричного мультивибратора на ОУ DA1 со скважностью Q = 100, что обеспечивается разными постоянными времени заряда и разряда конденсатора: C1R4 = 100 C1R3. Стабилитрон VD3 стабилизирует амплитуду положительных и ограничивает амплитуду отрицательных импульсов DA1. На выходе DA2 формируются короткие отрицательные и длинные положительные импульсы. Отрицательные импульсы отпирают составной эмиттерный повторитель (транзисторы VT1, VT2), питающий светодиод. Отрицательная ОС по току (R6, R7, R10) стабилизирует амплитуду тока светодиода, которая рассчитывается по формуле

.

Диод VD4 и двусторонний стабилитрон VD5 служат для защиты. Измерение и преобразование выполняется на интервале свечения светодиода.

Перед началом работы производится обнуление прибора. Для этого в кювету заливается трансформирующий раствор, и, регулируя U _оп, на индикаторе выставляют ноль. Затем в кювету заправляют калибровочный раствор, например «Реанал», и, вращая ручку калибровки, устанавливают на индикаторе число «150» (г/л).

Аналогичным по устройству и принципу действия является анализатор билирубина АБФ-Ц-01. Он используется в биохимических лабораториях для диагностики гепатита и других заболеваний, связанных с кровью. В отличие от гемоглобинометра проба здесь заливается через специальную воронку в измерительную камеру.

Универсальные фотометры, как уже отмечалось выше, перестраиваются на различные методики. Их общими узлами являются оптические и вычислительные системы. Как правило, они – полуавтоматические: вычисления (расчет концентрации, оптической плотности и др.) в них выполняются автоматически, а смена кювет и их перемещение производятся вручную. Примерами таких полуавтоматических фотометров являются приборы КФК-2ПМ и КФК-3. Они относятся к псевдодвухлучевым фотометрам. Аппарат КФК-2ПМ имеет встроенный калькулятор, а КФК-3 является микропроцессорным прибором. Рассмотрим его подробнее.

Структурная схема этого аппарата приведена на рис. 2.23. Оптическая система выполнена с перестраиваемой длиной волны на основе дифракционной решетки. Регулятор длины волны сопряжен с индикатором. Луч света из оптической системы проходит через стандартную кювету КС или рабочую кювету КР. Фотометрический блок ФМБ выполнен на основе фотодиода ФД-288Б (см. рис. 2.16). Микропроцессорная система выполнена на основе серии КР580 по классической схеме. В качестве ППИ использованы две микросхем КР580ВВ55. АЦ преобразование сигналов, поступающих от ФМБ, осуществляется аппаратно-программным способом с помощью ЦАП и компаратора К. На структурной схеме не показан селектор адреса.

Кюветы перемещаются с помощью ручного механизма – рычажка. В левом положении рычажка луч проходит через кювету КС. При этом замкнут левый концевой переключатель ЛКП. Он инициирует через ППИ запуск работы микропроцессорной системы. ЦПЭ начинает перебирать натуральные числа, начиная с нуля и выставляя их на шине данных. Через ППИ они поступают на цифровые входы ЦАП. Напряжение на выходе ЦАП растет по линейному закону. Когда оно достигнет величины, равной напряжению, поступающему от фотометрического блока ФМБ, компаратор К выключится (ноль на выходе). По этому сигналу процесс АЦ преобразования останавливается, и данные записываются в ОЗУ. Таким образом, получают отсчет по кювете КС. При переводе рычажка в правое положение под луч подставляется кювета КР и замыкается правый концевой переключатель ПКП. Снова инициируется процесс АЦ преобразования и получается отсчет по кювете КР. Такой способ АЦ преобразования требует, вообще говоря, меньше аппаратных затрат.

Оптическая плотность рассчитывается по алгоритму

,

где U ₁, U ₂ – напряжения, получаемые соответственно от кювет КС и КР. Концентрация раствора автоматически вычисляется по формуле

,

где F – коэффициент факторизации (фактор): . Эта величина вычисляется заранее опытным путем и вводится в память МПС перед проведением анализов.

Оригинальным решением является узел индикации длины волны. Как говорилось ранее, длина волны излучения, получаемого с помощью дифракционной решетки, пропорциональна углу ее поворота. Эта зависимость лежит в основе работы этого узла (рис. 2.24).

Ручка регулятора механически связана с осью многооборотного потенциометра R_П и осью дифракционной решетки (см. рис. 2.12). При ее вращении происходит перестройка длины волны и изменение потенциала на движке потенциометра, пропорционально длине волны. Это напряжение поступает на вход АЦП типа К572ПВ2. На его выходе включены семисегментные индикаторы, которые показывают величину длины волны с точностью до нм. Питающее напряжение на потенциометр поступает с повторителя на ОУ DA1, на неинвертирующий вход которого подается напряжение стабилитрона VD1.

Спектральная чувствительность кремниевых фотодиодов растет с увеличением длины волны. Для ее выравнивания одновременно с увеличением длины волны уменьшают выходное напряжение стабилизатора, питающего источник света (галогенную лампу). Это достигается подачей напряжения с потенциометра R_П на управляющий вход стабилизатора.

Одним из типов фотометрических приборов является аппарат для иммуноферментного анализа АИФ-Ц-01С. В настоящее время разработано большое количество иммуноферментных тест-систем в области медицины для диагностики различных инфекционных заболеваний. Особенно большое значение имеет применение АИФ-Ц-01С при массовом эпидемиологическом обследовании населения, в диагностике СПИДа и гепатита В.

Иммуноферментный анализ возник в 1971 году, когда ряд ученых предложил использовать в иммуноанализе в качестве метки вместо радиоактивных изотопов ферменты. Иммуноферментный анализ основан на иммунохимической реакции взаимодействия антиген-антитело и использовании в качестве индикатора этой реакции маркированных ферментами антител или антигенов. По способу выполнения этот метод является гетерогенным, твердофазным, т.е. требует разделения компонентов и основан на использовании антигенов или антител, иммобилизированных на твердых носителях. В качестве твердых носителей при работе на АИФ-Ц-01С используются 96-луночные планшеты из полистирола с плоским дном. Методы иммуноферментного анализа бывают конкурентные и неконкурентные. Наиболее широкое применение в медицинской практике находит вариант неконкурентного метода. Неконкурентный «сэндвич-метод» простых антител позволяет определять не только антитела, но и антигены.

Неконкурентный метод лежит в основе большинства отечественных тест-систем, предназначенных для диагностики инфекционных заболеваний. Он основан на последовательном проведении иммунохимических реакций и детектировании образовавшегося комплекса антиген-антитело путем проведения ферментативной реакции и измерения оптической плотности продукта, которая прямо пропорциональна концентрации определяемого антигена или антитела. На рис. 2.25. приведена схема неконкурентного «сэндвич-метода» обнаружения антигена.

На рис. 2.26 изображен фотометрический блок аппарата АИФ-Ц-01С. В него входят 96-ти луночный планшет (12´8) стекловолоконный световод и фотоприемники ФП (фотодиоды). Световод разделяется на восемь рукавов, по которым свет одновременно подводится к восьми лункам. Снимаются фотосигналы параллельно по отдельным световодам с восьми лунок одного столбца. Электрические сигналы от ФП поступают на преобразователи, а с них через мультиплексор – на общий АЦП. Такой способ съема информации служит для повышения производительности аппарата.

Для наглядности сканирование планшета отображается с помощью табло из светодиодов (рис. 2.27). Пара светящихся светодиодов буквенного и цифрового рядов указывает, с какой лунки снимается сигнал. Работой аппарата и обработкой информации управляет микропроцессорная система, выполненная на базе серии К580. Перемещение планшета осуществляется с помощью шагового двигателя. Аппарат АИФ-Ц-01С выпускался в конце 80-х годов прошлого века.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: