Оптическое детектирование без метки

П На каждой поверхности раздела свет преломляется и/или отражается, давая информацию о веществах с каждой стороны поверхности.

Как видно из уравнения 7.8-33, при данной длине волны напряженность электрического поля затухающей волны будет меняться в соответствии с отношением показателей преломления двух фаз (световода, hi, и поверхностной среды, hi}. В биосенсорах, где поверхностный слой является местом протекания аналитической реакции, за реакцией можно следить непосредственно, если она вызывает изменение оптических характеристик слоя (подобных показателю преломления или толщине). Существует несколько способов усиления этих изменений, так что последние можно использовать в качестве аналитического сигнала.

Интерференционные методы

Когда объединяются две волны, они интерферируют друг с другом, либо конструктивно, либо деструктивно. Использование этого явления называют интерферометрией. Когда ее используют в биосенсоре, он обычно включает операцию с отражением во внутреннем режиме. Здесь мы обсудим два примера. Модель отражения, описанная выше, рассматривает только отражение от одной границы раздела. Однако, если вместе размещено несколько слоев, тогда на каждой границе происходит и отражение, и пропускание (рис. 7.8-19). Это, в конечном итоге, приводит к «смешанному» отражению, которое является комбинацией отражений от каждой из границ раздела. Интенсивность регистрируемого отражения есть функция толщины каждого слоя и совокупного показателя преломления. Она очень чувствительна к небольшим изменениям любого параметра, и, следовательно, может быть использована для детектирования взаимодействий на поверхности многослойника. Чтобы получить максимальную чувствительность, следует тщательно выбрать диэлектрический материал (диэлектрическая проницаемость е связана с показателем преломления, п = е¹/²). Непоглощающие диэлектрики (например, S102) с диэлектрической проницаемостью £1 = £i,_r (т. е. диэлектрическая проницаемость имеет только

Рис. 7.8-19. Отражение от многослойника.

действительный член) наносят с толщиной порядка А/4 на хорошо отражающую подложку с диэлектрической проницаемостью £q = £o,_r — i£o,i (например, кремний с комплексной диэлектрической проницаемостью). Изменения в био-распознающем слое, осажденном на поверхность слоя SiC>2, можно затем контролировать, измеряя и анализируя отражение, поскольку отраженные волны будут модулированы слоями. Такая многослойная система использована как преобразователь для связывания антитело-антиген [7.8-9]. Тем не менее, вообще говоря, для всех таких «безметочных» методов иммунного анализа неспецифическое связывание должно быть исключено или полностью охарактеризовано, если метод, в принципе, может быть использован в биосенсорах.

Для биосенсоров на основе интерферометрии существует важный момент — выбор точки сравнения. Необходимы два вида градуировки. Первый касается градуировки по определяемому веществу; второй требует информации о фоновом сигнале. Фон можно получить с помощью контрольного опыта; вопрос заключается в следующем: как можно включить контрольный опыт в биосенсор? В случае световодов, взаимодействующих с пробой посредством затухающего поля, это требует двух различимых поверхностей: одной —для специфических и другой —для неспецифических реакций. Одним из вариантов является конфигурация, подобная конфигурации в интерферометре Маха—Цендера (рис. 7.8-20). Сначала падающий свет разделяется,затем он проходит через све-

Рис. 7.8-20. Интерферометр Маха—Цендера.

товоды сравнения и пробы и впоследствии вновь объединяется. На интенсивность получаемого, многократно отраженного луча влияет длина оптического пути и отражение на границе раздела. Отражение, конечно, будет разным на поверхности, модифицированной биораспознающим компонентом, и поверхности сравнения. Когда неспецифические взаимодействия исключены, эту конфигурацию успешно используют для измерений связывания антитело-антиген.

Устройства ввода света в световод на основе решеток

D Чтобы улучшить измерения изменений показателя преломления, можно сконструировать различные оптические схемы.

Устройство ввода на основе решетки позволяет завести свет в световод. Решетка —это периодическая структура (например, треугольная, пилообразная, синусоидальная) (рис. 7.8-21), которая нанесена на поверхность световода. Когда свет падает на решетку он возбуждает в световоде проходящую моду в зависимости от периода решетки. Чтобы усилить эффект изменения показателя преломления на границе раздела, изменения, происходящие на поверхности решетки, надо перенести на световод. Например, на рис. 7.8-21 свет, падающий вблизи устройства ввода, будет возбуждать проходящие моды, зависящие от показателя преломления окружающей среды. В этом варианте поверхность становится чувствительной к тонким изменениям показателя преломления. Этот вариант, следовательно, подходит для проведения безметочного иммунного анализа, поскольку связывание между иммобилизованным антителом и антителом пробы дает большую плотность этих молекул на расстоянии порядка длины волны вглубь от поверхности (заметьте, что глубина проникновения света составляет величину порядка длины волны, уравнение 7.8-34) и, таким образом, приводит к изменению показателя преломления. Например, конкурентный иммунный анализ можно применить для определения пестицидов, при этом на модифицированной аминосиланом поверхности устройства связи ковалентно иммобилизован триазиновый гаптен, а связывание антитела детектируют за счет измерения угла несвязывания [7.8-53, 7.8-54]. Чтобы детектировать присутствие триазиновых пестицидов, пробу следует предварительно выдержать с антителами, а затем — перенести к иммобилизованному гаптену. Очевидно, чтобы обеспечить невмешательство пользователя в эту процедуру анализа, в устройстве должен быть предусмотрен этап выдержки.

Рис. 7.8-21. Устройство связи на основе решетки.

Поверхностный плазменный резонанс (ППР)

В этом методе световод покрывают тонкой пленкой металла (плазмона) и измеряют изменения поля, проходящего вдоль поверхности металлической пленки. Эти изменения обусловлены тем, что воздействие внешнего электрического поля (в световоде) достаточной напряженности (см. ур. 7.8-33) передает энергию из световода и образуются осциллирующие поверхностные заряды, которые распространяются по поверхности металла. Колебания заряда должны быть связаны с E_z (полем, расширяющимся в направлении г), так что металлическая поверхность должна быть на должном расстоянии от поверхности световода в пределах глубины проникновения d_p затухающего поля. Для волны поверхностного плазмона, существующей между двумя средами с диэлектрической проницаемостью е\ и £2 (рис. 7.8-22), волна ограничена на границе раздела волновым вектором k_x в направлении распространения и k_zi и k_Z2 в направлениях +z и -г. Условию непрерывности на границе отвечает соотношение

(7.8-35) Следовательно, k^ определяется выражением

(7.8-36)

D Поверхностный плазменный резонанс есть колебание поверхностных зарядов (электронов в металле), распространяющееся по поверхности.

Волну поверхностного плазмона можно возбудить падающим светом той же частоты и имеющей составляющую k_x. Для света, падающего на металл с диэлектрической проницаемостью £2 из диэлектрического материала с е*з> составляющая k_x определяется выражением

(7.8-37)

где 9 — угол падения.

Плазменный резонанс на £1/£2-границе металла, следовательно, можно возбудить, когда составляющие k^ падающей и плазменной волн совпадают:

(7.8-38)

Рис. 7.8-22. Конфигурации возбуждения для поверхностного плазменного резонанса, а — конфигурация Кречмана с контактом через тонкую металлическую пленку; б — конфигурация Отто, обеспечивающая контакт сквозь воздушный зазор.

Чтобы это произошло, должно выполняться условие £з > £i.

Экспериментально резонанс наблюдают как минимум отражения при угле падения в. Из уравнения 7.8-38 можно сделать вывод, что изменение £i потребует изменения в, чтобы сохранить условия резонанса, так что контроль положения минимума отражения очень чувствителен к реакции на поверхности металла (ei). Это является источником сигнала, измеряемого сенсором^ППР, так как поверхность металла можно модифицировать с помощью биораспо-знающей молекулы, которая будет давать отклик на определяемое вещество, меняя £i на границе раздела.

Две конфигурации устройств ППР показаны на рис. 7.8.-22. В ранних сообщениях по применению ППР для детектирования связывания белков речь шла об исследованиях взаимодействий без метки, с участием, например, антител, иммобилизованных на металлических пленках [7.8-55, 7.8-56]. Скоро стало ясно, что хотя можно детектировать связанный антиген, в некоторых аналитических средах часто не было возможности отличить этот сигнал от сигнала любого другого неспецифического взаимодействия с поверхностью [7.8-57]. Показатель преломления в качестве метки и другие оптические метки помогут обойти эту проблему, и, поскольку ППР столь чувствителен, достижимы низкие пределы обнаружения.

Большинство приложений этого метода лежит в области иммунного анализа или других методов со связыванием белков, а не в ферментативном анализе. Чтобы установить, возможно ли какое-либо новое приложение, необходимо выяснить, как связать измеряемый параметр с тем, что в данном методе анализа непременно должно происходить изменение £ на поверхности. Многие из определений, основанных на связывании между иммобилизованной биораспо-знающей молекулой и определяемым веществом, могли бы пригодиться, если разница между несвязанной и связанной с определяемым веществом распознающей молекулой достаточно велика и если реагенты можно иммобилизовать с сохранением их реакционной способности. Например, последовательность ДНК-зондов иммобилизована на модифицированной тиолом серебряной пленке, нанесенной на световод в варианте ППР [7.8-22]. Зонд проявляет характеристическое изменение в возбуждении ППР при связывании комплементарной ДНК (рис. 7.8-23). Однако, когда та же последовательность ДНК-зондов была нанесена на поверхность с помощью силана, зонд не смог связывать комплементарную ДНК и, таким образом, потерпел неудачу в качестве биосенсора. Это наблюдение заставляет нас рассматривать метод иммобилизации биорас-познающего компонента как важнейший в конструировании биосенсора.

Заключение

Эта глава дает краткий обзор компонентов биосенсора. Она концентрирует внимание на двух основных классах биосенсоров, а именно — электрохимических и оптических, но не следует ограничиваться только этими примерами. Как сказано в начале главы, возможности конструирования биосенсоров настолько широки, насколько широко ваше воображение. Критериями успеха

являются выбор соответствующего параметра для измерений, хороший метод иммобилизации, который можно легко приспособить для серийного производства, и пригодность вашего измерения для избранного приложения!

Литература

[7.8-1] Hall, E.A.H., Biosensors. Milton Keynes: Open University Press, 1990.

[7.8-2] Cass, A.E.G. (Ed.), Biosensors: A Practical Approach. Oxford: IRL Press,

1990. [7.8-3] Gopel, W., Hesse, J., Zemel, J.N., (Eds.), Sensors: A Comprehensive Survey,

Weinheim: VCH, 1991, Vols. 2 and 3. [7.8-4] Wolfbeis O.S. (Ed.), Fiber Optic Chemical Sensors and Biosensors, Florida: CRC

Press, 1991, Vols. I and II. [7.8-5] Ikeda, Т., Hamada, H., Miki, K., Senda, M., Agric. Biol. Chem. (Japan), 1984,

49, 541-543.

[7.8-6] Randriamahazaka, H.N., Nigretto, J.M., Electroanalysis, 1993, 5, 231-241. [7.8-7] Amine, A., Kaufman, J.M., Patriarche, G.J., Talanta, 1991, 38, 107. [7.8-8] Wang, J., Wu, L.H., Lu, Z.L., Li, R.L., Sanches, J., Anal. Chim. Ada, 1990, 228,

251.

[7.8-9] Dushl, C., Hall, E.A.H., J. Coll. Int. Sci., 1991, 114, 368-380. [7.8-10] Kutner, W., Storck, W.,Doblhofer, K., J. Incl. Phenom., 1992, 13, 257. [7.8-11] Hale, P.D., Lan, H.L., Boguslavsky, L.I., Nagan, H.I., Okamoto, Y., Skotheim,

T.A., Anal. Chim. Ada, 1991, 251, 121. [7.8-12] Yon Hin, B.F.Y., Smolander, M., Compton, Т., Lowe, C.R., Anal Chem., 1993,

65, 2067.

[7.8-13] Martens, N., Hall, E.A.H., Anal. Chim. Ada, 1994, 292, 49-63. [7.8-14] Hench, L.L., West, J.K., Chem. Rev., 1990, 90, 33-72. [7.8-15] Braun, S., Rappoport, S., Zusman, R., Avnir, D., Ottolenghi, M., Materials Lett.,

1990, 10 (1,2), 1-5. [7.8-16] Narang, U., Psasad, P.N., Bright, F.V., Ramanathan, K., Kumar, N.D., Malhotra,

B.D., Kamalasanan, M.N., Chandra, S. Anal. Chem., 1994, 66, 3139. [7.8-17] Hall, C.E., Hall, E.A.H., Anal. Chim. Ada, 1993, 281, 645-653. [7.8-18] Urban, G., Jobst, G., Kepplinger, F., Aschauer, E., Tilado, O., Fasching, R., Kohl,

F., Biosensors Bioelectronics, 1992, 7, 733.

[7.8-19] Urban, G., Jobst, G., Aschauer, E., Tilado, O., Svasek, P., Varahram, M., Ritter, Ch., Riegebaure, J., Sensors and Actuators, 1994, 18—19, 592.

Рис. 7.8-23. Зонд на иммобилизованной ДНК, основанный на поверхностном плаз-монном резонансе на серебряной плен ке.

[7.8-20] Hall, Е.А.Н., Hall, С.Е., Martens, N., Mustan, N., Datta, D., Uses of Immobilized

Biological Compounds, in: AST Series &5&: Guilbault, G.G., Mascini, M., (Eds.),

Kluwer Academic Publishers, 1991.

[7.8-21] Willner, I., Riklin, A., Anal Chem., 1994, 66, 1535. [7.8-22] Liley, M.J., Surface Plasmon Resonance for the Detection of DNA Hybridisation,

PhD Thesis, University of Cambridge, 1990.

[7.8-23] Martens, N., Hindle, A., Hall, E.A.H., Biosensors Bioelectronics, 1995. [7.8-24] Leypoldt, J.K., Gough, D.A., Anal. Chem., 1984, 56, 2896. [7.8-25] Cass, A.E.G., Francis, G., Hill, H.A.O., Higgins, I.J., Aston, W.J., Plotkin, E.V.,

Scott, L.D.L., Turner, A.P.F., Anal. Chem., 1984, 56, 667. [7.8-26] Degini, Y., Heller, A., J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 2615. [7.8-27] Schlapfer, P., Mindt, W., Racine, P., Clin. Chim. Ada, 1974, 57, 283. [7.8-28] Martens, N., Hall, E.A.H., Anal. Chem., 1994, 66, 2763-2770. [7.8-29] Clark, L.C. Jr., Lyons, C., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1962, 102, 29. [7.8-30] Nicholson, R.S., Shain, L., Anal. Chem., 1964, 36, 706. [7.8-31] Davies, P., Green, M.J., Hill, H.A.O., Enzyme Microb. Technol, 1986, 8, 349-

352. [7.8-32] diGleria, K., Hill, H.A.O., McNiel, C.J., Green, M.J. Anal Chem., 1986, 58,

1203.

[7.8-33] Wang, J., Chen, Q., Electroanalysis, 1994, 6, 850. [7.8-34] Khan, G.F., Kobatake, E., Ikariyama, Y., Aizawa, M., Anal. Chim. Ada, 1993,

281, 527-533.

[7.8-35] D'Costa, E.J., Higgins, I.J., Turner, A.P.F., Biosensors, 1986, 2, 71-87. [7.8-36] Wang, J., Naser, N., Anal Chim. Ada, 1991, 242, 259. [7.8-37] Desphande, M.K., Hall, E.A.H., Biosensors Bioelectronics, 1990, 5, 431-448. [7.8-38] Chen, Y., Tan, T.C., Biosensors Bioelectronics, 1994, 9, 401-410. [7.8-39] Carpentier, R., Lemieux, S., Mimeault, M., Purcel, M., Goetze, B.C.,

Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1989, 22, 391-401.

[7.8-40] Martens, N., Hall, E.A.H., Photochem. and PhotobioL, 1994, 59, 91-98. [7.8-41] Glab, S., Koncki, R., Hulanicki, A., Electroanalysis, 1991, 3, 361-364. [7.8-42] Bergveld, P., Stimulus Response Measurements on Protein Containing

Membranes, Deposited on an ISFET Surface, in: Uses of Immobilized Biological

Compounds: Guilbault, Mascini, (Eds.) Netherlands: Kluwer, 1993, pp. 289-

308. [7.8-43] Cowell, B.C., Bowman, A.A., Lewis, R.J., Pirzad, R., Watkins, S.B., Biosensors

Bioelectronics, 1994, 9, 131-138. [7.8-44] Shasfoort, R.B.M., Bergveld, P., Bomer, J., Kooyman, R.P.H., Greve, J., Sensors

and Actuators, 1989, 17, 531.

[7.8-45] Aizawa, M., Kato, S., Suzuki, S., J. Membrane Sci., 1977, 2, 125-130. [7.8-46] Shasfoort, R.B.M., Bergveld, P., Kooyman, R.P.H., Greve, J., Biosensors

Bioelectronics, 1991, 6, 477-489. [7.8-47] Lippitsch, M.E., Pusterhofer, J., Leiner, M.J.P., Wolfbeis, O.S., Anal. Chim. Ada,

1988, 205, 1. [7.8-48] Bannwarth, W., Schmidt, B. Stallard, R.L., Hornung, C., Knorr, R., Mueller, F.,

Helv. Chim. Ada, 1988, 71, 2085. [7.8-49] Hlavay, J., Haemmerli, S.B., Guilbault, G.G., Biosensors Bioelectronics, 1994, 9,

189-195.

[7.8-50] Krull, 1989. [7.8-51] Offenbacher, H., Wolfbeis, O.S., Furlinger, E., Sensors and Actuators, 1986, 9,

73-79.

[7.8-52] Mansouri, S., Schultz, J.S., Bio/Technology, 1984, 2, 385. [7.8-53] Nellen, P.M., Lukosz, W., Biosensors Bioelectronics, 1991, 6, 517-525.

6 Обработка сигналов: цифровая фильтрация, преобразование данных

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: