II.2. Непрямые иммуноанализы

Непрямые методики применяют шире, чем прямые. Непрямыми иммуноанализами называют анализы, в которых метку присоединяют не к целевому Аг и не к АТ против целевого Аг, а к так называемым вторым АТ - антивидовым антииммуноглобулиновым АТ, т.е. АТ к иммуноглобулинам того вида животных или человека, с биологическим материалом которого работают. Таким образом, один и тот же препарат конъюгата антиглобулиновых АТ с ферментом используют в качестве проявляющего стандартного реагента в разных тест–системах для определения различных конкретных Аг или АТ.

Чувствительность иммуноанализов. Термин «чувствительность» применительно к иммуноанализам имеет два разных смысла. Во-первых, физико-химический как минимально определяемая данным анализом концентрация искомого вещества в пробе. Как правило, для большинства ИФА тест–систем чувствительность в этом понимании составляет нанограммы в миллилитре. Второе понимание термина «чувствительность» популяционное и относится к диагностическим тест-системам, предназначенным для выявления тех или иных маркёров заболеваний, чаще всего инфекционных. При разработке любой тест-системы пользуются биологическим материалом, например пробами крови, от людей, заведомо больных данным заболеванием (эти пробы называют истинно позитивными), и от людей, заведомо не больных данным заболеванием (эти пробы называют истинно отрицательными).

Параметры рассчитывают по приведенным ниже формулам, где N - число тех или иных результатов конкретных анализов на биологическом материале от пациентов с достоверно известными диагнозами.

Специфичность иммуноанализов. Специфичность диагностической тест–системы характеризует её распознавательные возможности в отношении именно данного заболевания, которое она «не путает» с другими.

Диагностическая эффективность тест–системы. Она характеризует возможности данной тест–системы одновременно правильно определять позитивные пробы как позитивные, а негативные пробы как негативные.

Положительная (ППЗ) и отрицательная предсказательная значимость (ОПЗ) тест–системы. Эти характеристики в отличие от приведенных выше чувствительности и специфичности подразумевают знание реальной распространённости данного инфекционного заболевания в обследуемых популяциях населения.

ППЗ рассчитывают как частоту инфицированных людей среди всех индивидуумов, определённых данной тест–системой как позитивные.

Отрицательную предсказательную значимость тест–системы рассчитывают как частоту неинфицированных людей среди всех индивидуумов, определённых данной тест–системой как отрицательные.

Метод ELISPOT

ELISPOT - Enzyme–Linked ImmunoSpot Assay - анализ иммуноферментно меченных пятен.

Цель - посчитать индивидуальные клетки, продуцирующие и секретирующие тот или иной растворимый белок (АТ, цитокины и др.).

Средства:

1) высокоспецифичные АТ (или иной специфичный лиганд) к целевому белку;

2) специальные культуральные плэйты с дном из пористой твёрдой фазы (нитроцеллюлозы или подобного материала), на которой бы сорбировались и иммобилизовались и клетки и секретируемый из них продукт;

3) Знание свойств исследуемых клеток в такой мере, которая бы позволяла понимать, чем и как стимулировать продукцию и секрецию искомого вещества (АТ, цитокинов или другого) интересующими клетками.

Технология, этапы постановки метода: в основе - сэндвич–ИФА. Следовательно, используют два препарата АТ, специфичных к искомому продукту (цитокину или др.): один из них — ловушка на твёрдой фазе, второй - конъюгат с биотином, если фермент конъюгирован с авидином или стрептавидином.

Стерильные условия работы:

1) антицитокиновое AT₁ сорбируют на пористой твёрдой фазе культурального плэйта (это АТ-ловушка для секретируемого цитокина);

2) в эти плэйты помещают исследуемые клетки (суспензию в различных концентрациях — от 10⁵ до 2х10⁶ в 1 мл);

3) к клеткам добавляют стимулятор в различных концентрациях;

4) систему культивируют в идеальных условиях в течение 2–24 ч или больше (подбирают оптимум).

Нестерильные условия работы:

5) лунки тщательно промывают сначала водой с целью удаления клеток, затем отмывочным буфером с детергентом (0,05% Tween–20), чтобы смыть все, что плохо связалось;

6) в лунки вносят конъюгат проявляющего АТ-АТ₂ с биотином, инкубируют 2 ч;

7) промывают и вносят конъюгат авидин-пероксидазу, инкубируют 1 ч;

8) промывают и вносят субстратную смесь - АЕС [3-амино-9-этилкарбазол, растворенный исходно в N₁N-диметилформамиде - DMF (100 мг АЕС на 10 мл DMF) и разбавленный до конечной концентрации в 0,1 M ацетатном буфере, pH 5,0 и плюс пероксид водорода.

Рецепт субстратной смеси: 333,3 мкл матричного раствора АЕС + 10 мл ацетатного буфера + 5 мкл 30% перексида водорода];

9) реакцию останавливают под визуальным контролем через 5–50 мин путём промывки плэйтов водой;

10) плэйты сушат при комнатной температуре в темноте в течение примерно 2 ч;

11) регистрируют результат, т.е. подсчитывают пятна либо «вручную» под соответствующим микроскопом, либо в специальном аппарате, считывающем картину дна лунок видеокамерой и соответствующей компьютерной программой анализа пятен.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: