Доказательства тотипотентности генома

Как, с точки зрения генетика, развивается организм многоклеточного животного? Мы знаем, что существует много специализированных тканей. Возникает вопрос, сохраняются ли в ядре клеток кишечника гены, необходимые, например, для синтеза гемоглобина — белка, характерного для эритроцитов, а в ядре нервной клетки — гены, необходимые для синтеза трипсина?

Если «ненужные» гены утрачиваются, то именно эта постоянная утрата различных генов и определяет специализацию клеток, как предположил А. Вейсман еще в 1892 г. Противоположная точка зрения сводится к тому, что во всех клетках сохраняются все гены, однако в тех клетках, где их деятельность не нужна, они находятся в неактивном состоянии.

Для того чтобы решить, какая из этих гипотез верна, использовали метод трансплантации ядер. Впервые в мире в 1941 г. советский эмбриолог Георгий Викторович Лопашев разработал метод пересадки ядер в яйцеклетку тритона.

Джон Гёрдон в 1962 г. трансплантировал ядра из специализированных клеток эпителия кишечника головастиков южноафриканской шпорцевой лягушки Xenopus laevis в неоплодотворенное яйцо этого же вида, из которого предварительно было удалено свое ядро. При этом необходимо было использовать какой-либо ядерный маркер, который позволяет отличить потомков пересаженного ядра от потомков ядра-хозяина, поскольку нельзя быть уверенным, что не произошла случайная ошибка при удалении ядра-хозяина. Маркером в данном случае служило наличие двух ядрышек в ядрах клетки-хозяина и одного — в пересаживаемых ядрах.

Клетки кишечного эпителия выбрали потому, что они крупные, имеют яркий признак дифференцированности – кишечные ворсинки.

В этих экспериментах лишь из 1% яиц, в которые были пересажены ядра эпителия, выросли взрослые лягушки. Таким образом была доказана тотипотентность генома любой, даже дифференцированной клетки (т. е. широкая потенция к развитию).

В 1997 г. группа ученых из Шотландии под руководством Вилмута провели успешную трансплантацию ядер из дифференцированных клеток в яйцеклетки овец и получили знаменитую овечку Долли.

Схема опыта была подобна той, которую использовали Дж. Гёрдон и его сотрудники. Маркерами в данном случае служила масть овец. Ооциты выделяли из овец шотландской черномордой породы, а донорные клетки были выделены из вымени овец беломордой породы. После этого с помощью электрического импульса сливали энуклеированный ооцит с целой клеткой-донором. Полученные зиготы помещали в яйцеводы самок, где они начинали дробиться и развивались в морулы, которые и были пересажены в матки черномордых овец. Из 277 экспериментально полученных зигот только одна прошла все стадии развития вплоть до рождения ягненка, который был беломордым.

Позднее овечке Долли был поставлен диагноз – синдром преждевременного старения. Это свидетельствует о том, что генетический материал из клетки взрослого организма необратимо запрограммирован на сокращенную продолжительность жизни (ограниченное число клеточных делений).

Существуют планы выращивания клонированных животных, которые могли бы быть источником органов для пересадки больным людям. Здесь наиболее привлекательным объектом являются свиньи. Планируется в ядре культивируемой клетки свиньи вначале инактивировать гены, ответственные за синтез в клетках полисахаридов, которые организмом человека опознаются в качестве чужих и вызывают иммунный ответ.

В исследованиях растений проблема тотипотентности не возникала, так как всем известно, что кусочки листа (т. е. соматические клетки) бегонии дают новые растения с цветами и семенами, точно так же корневые побеги малины ежегодно дают начало новым растениям, а картофель размножается клубнями. Целые растения вырастают и из отдельных клеток, входящих в состав каллуса.

Детерминация

Детерминация – возникновение качественных различий между частями развивающегося организма, которые предопределяют дальнейшую программу развития. Детерминация предшествует дифференцировке и морфогенезу.

Дифференцировка – процесс, в результате которого клетка становится специализированной, т.е. приобретает биохимические, морфологические и функциональные особенности (это происходит на протяжении нескольких циклов деления). Необратимый процесс.

Морфогенез – процесс возникновения новых структур и изменения их формы в ходе индивидуального развития. Необратимый процесс. На надклеточном уровне начинается с гаструляции.

Другими словами, детерминация – это установление на генетическом уровне определенной стратегии развития какой-то части эмбриона.

Большой вклад в изучение детерминации внес швейцарский генетик Эрнст Хадорн. Известно, что в развитии высших насекомых, в том числе дрозофилы, происходит интересное разделение клеток по их функциям. Клетки одного типа начинают дифференцироваться с первых этапов эмбрионального развития, из них образуется тело личинки насекомого со всеми его органами. Клетки другого типа обособлены, они составляют так называемые имагинальные диски, или зачатки взрослых органов. Хотя клетки имагинальных дисков находятся в контакте с соседними дифференцирующимися клетками, они пребывают в эмбриональном состоянии в течение всего личиночного периода. В это время они делятся.

В процессе метаморфоза значительная часть личиночных органов рассасывается (лизируется). Одновременно с этим клетки имагинальных дисков утрачивают свое эмбриональное состояние, они дифференцируются, превращаясь в специализированные ткани имаго (взрослой мухи). Из каждого диска образуется отдельная часть тела насекомого. Например, для каждой из шести будущих ног существует отдельный диск, голова образуется из трех пар дисков.

Имагинальные диски можно извлечь из тела личинки и пересадить в полость тела другой личинки. Когда личинка-хозяин превращается в куколку, трансплантант дифференцируется в соответствующий орган. Например, если трансплантирован глазной имагинальный диск, в брюшке куколки и мухи развивается полностью сформировавшийся глаз.

Неожиданные результаты были получены после трансплантации имагинальных дисков сразу во взрослых мух. Клетки неограниченно делились и разрастались.

Если бы развитие этих имагинальных дисков происходило в личинке, то эти клетки прекратили бы деление с началом метаморфоза: под влиянием гормона насекомых экдизона они бы начали дифференцироваться в куколке в различные структуры взрослых особей, но в данном случае этого не произошло.

Неограниченный рост этих клеток, пересаженных в брюшко взрослых мух, продолжался более 6 лет. Поскольку дрозофила живет около месяца, размножающиеся клетки пересаживали в новую муху через каждые 2 недели. При этом клетки перенесли свыше 160 пересадок. Хотя трансплантанты жили во взрослых мухах годами, они сохранили свой исходный эмбриональный характер и не дифференцировались. Если же извлечь немного трансплантанта и ввести в личинку, эти клетки претерпевали метаморфоз и нормально дифференцировались в структуры взрослого организма. При этом если несколько лет назад для трансплантации были взяты имагинальные диски крыла, то при обратной трансплантации также формировалось крыло. Таким образом, состояние детерминации может воспроизводиться длительное время без каких-либо изменений.

Очень редко из клеток генитального имагинального диска после длительного размножения в брюшке имаго формировались органы головы или конечности, т. е. клетки больше не дифференцировались в соответствии с детерминацией их предков — происходила трансдетерминация.

Явление трансдетерминации свидетельствует о том, что детерминация не сопровождается необратимыми изменениями генов, тем более их потерей.