Определить количество редуцирующих cахаров в гидролизате крахмала. Для этого следует использовать йодометрический и глюкозооксидазный методы.

- Йодометрический метод определения редуцирующих cахаров, основанный на способности йода в щелочной среде окислять альдосахара в соответствующие кислоты:

CH₂OH–(CHOH)₄–CHO + I₂ + 3 NaOH →

глюкоза (альдосахар)

→ CH₂OH –(CHOH)₄–CO(ONa) + 2 NaI + 2 H₂O

глюконовая кислота

Избыток йода титруют тиосульфатом натрия:

I₂ + 2 Na₂S₂O₃ → 2 NaI + Na₂S₄O₆

I₂ + 2e → 2 I^2-

2 S^2- - 2e → S₂^2-

На анализ отбирают 25 мл полученного ранее нейтрализованного гидролизата и переносят в коническую колбу для титрования. С помощью пипеток вносят 10 мл 0,1 н раствора йода и сразу вслед за этим – 20 мл 0,1 н раствора едкого натра (щелочь вносят по каплям при перемешивании!). Колбу с опытным раствором закрывают бумажным колпачком и оставляют на 15 минут в темном месте.

По истечении 15 минут к раствору добавляют 20 мл 0,1 н раствора серной кислоты, а также по каплям 1% раствор крахмала до тех пор, пока раствор не приобретет насыщенный фиолетовый цвет вследствие взаимодействия крахмала с избыточным непрореагировавшим йодом. Затем полученный раствор титруют 0,1 н раствором тиосульфата натрия до полного обесцвечивания.

Одновременно ставят контрольный опыт с теми же количествами реагентов, с той лишь разницей, что вместо 25 мл гидролизата берут 25 мл дистиллированной воды. Объем 0,1 н раствора йода, пошедшего на окисление глюкозы до глюкуроновой кислоты, определяют по разности объемов тиосульфата натрия, пошедшего на титрование контрольного и опытного растворов. Разница в объемах контроля и опыта должна составлять 0,5-6 мл. Если она меньше 0,5 мл или больше 6 мл, то титрование повторяют с большим или меньшим соответственно объемом гидролизата.

По полученным данным проводят расчет:

Условная крахмалистость (УК) сырья определяется по формуле:

УК = , % (1.1)

где – количество глюкозы в навеске сырья по результатам титрования, соответствующая содержанию крахмала в сырье, г;

0,9 – коэффициент пересчета количества глюкозы на условный крахмал;

М – навеска анализируемого сырья с учетом влажности (обычно от 11 до 40 %), г.

Согласно уравнению ниже на титрование 1 грамм-эквивалента глюкозы приходится 1 грамм-эквивалент йода:

С₆Н₁₂О₆ + 3 NaOH + I₂ → C₆H₁₁O₇Na + 2 NaI + 2 H₂O

М.м. глюкозы = 180 М.м. йода = 2 · 126,9 Х 12,6 мг (1 мл 0,1 н раствора йода содержит 12,6 мг)

Х = 9,008 мг

Итак, из вышеуказанной пропорции находим, что 1 мл 0,1 н раствора тиосульфата натрия соответствует 9,008 мг глюкозы.

Тогда количество глюкозы в опытном растворе определяется по формуле

= , г(1.2)

где V_к – объем 0,1 н раствора тиосульфата натрия (Nа₂S₂О₃), пошедшего на титрование контрольного опыта, мл;

V_о – объем 0,1 н раствора тиосульфата натрия (Nа₂S₂О₃), пошедшего на титрование опытного раствора, мл;

9,008 – количество глюкозы, соответствующее 1 мл 0,1 н раствора йода, мг;

V_а – 25 мл – объем пробы опытного раствора, отобранной на анализ;

1000 – коэффициент пересчета миллиграмм в граммы;

n – коэффициент пересчета разбавлений.

n = , (1.3)

где V₁ – объем клейстеризованной пробы (100 мл);

V₂ – объем фильтрата, отобранного на кислотный гидролиз (20 мл);

V₃ – объем фильтрата с учетом разбавления (100 мл);

V₄ –объем гидролизата, отобранного на нейтрализацию (40 мл);

V₅ – объем содержимого колбы (50 мл);

V₆ – объем пробы, отобранной на титрование (25 мл).

k – поправочный коэффициент 0,1 н раствора йода:

k = V_и/V_тс, (1.4)

где V_и – 10 мл – объем 0,1 н йода, взятого на титрование для определения поправочного коэффициента;

V_тс – объем 0,1 н раствора тиосульфата натрия (Nа₂S₂О₃), пошедшего на титрование 10 мл 0,1 н раствора йода, мл.

Результаты измерений и расчетов заносят в таблицу 2.

Таблица 2 – Результаты эксперимента

№	Вид сырья	Навеска сырья, М	Vo	Vк	Vк – Vо	k	n		УК, %
	Пшеничная мука	1,5 г
	Крахмал	1 г

- Глюкозооксидазный метод определения редуцирующих cахаров

Ферментный препарат на основе глюкозооксидазы применяется в аналитике, благодаря высокой специфичности по отношению к β-D-глюкозе. Даже в отношении своего аномера – α-D-глюкозы – способность фермента к окислению в 150 раз ниже.

ФАДН₂ + О₂ → ФАД + Н₂О₂

лактон глюконовой кислоты

глюконовая кислота

Фермент представляет собой флавопротеин. На первом этапе ферментативная реакция протекает с образованием лактона глюконовой кислоты и восстановлением простетической группы ФАД. Образовавшийся лактон спонтанно гидролизуется до глюконовой кислоты.

Далее восстановленная форма ФАД передает протоны на кислород с образованием перекиси водорода в количестве, эквимолярном окисленной глюкозе. Присутствующая в растворе пероксидаза катализирует окисление гексацианоферроата перекисью водорода с образованием окрашенного соединения гексацианоферриата калия:

_{пероксидаза}

K₄ [Fe(CN)]₆ + O₂ + H₂O 4K₃[Fe(CN)]₆ + 4KOH

В результате реакции раствор приобретает лимонно-желтый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству глюкозы в растворе (гидролизате). Вместо гексацианоферроата калия применяют о‑дианизидин или смесь 4-аминоантипирина с фенолом.

Интенсивность окраски определяют на фотоколориметре. Содержание глюкозы в опытном растворе рассчитывают по формуле (1.5).

Для проведения анализа готовят раствор глюкозооксидазы из стандартного реактива (см. приложение). В три пробирки вносят реактивы следующим образом:

- контрольная проба – 2 мл рабочего раствора глюкозооксидазы;

- опытная проба – 0,2 мл раствора, в котором определяется содержание глюкозы и 2 мл рабочего раствора глюкозооксидазы;

- калибровочная проба – 0,2 мл калибровочного раствора глюкозы (1ммоль/л) и 2 мл рабочего раствора глюкозооксидазы.

Пробирки инкубируют 15 минут при температуре 37 °С или 30 минут при температуре 20 С. Через 5-10 минут после начала инкубации пробирки интенсивно встряхивают. После окончания инкубации определяют оптическую плотность при длине волны 510 нм (470-540 нм, зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против калибровочной пробы. Окраска устойчива в течение 1 часа после окончания инкубации.

По полученным данным проводят расчет:

= (D_o / D_к) · 10, (1.5)

где – концентрация глюкозы в опытной пробе, ммоль/л;

D_o – оптическая плотность опытной пробы;

D_к – оптическая плотность калибровочной пробы;

10 – содержание глюкозы в калибровочной пробе, ммоль/л.

Результаты измерений и расчетов заносят в таблицу 2.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: