Главная

Популярная публикация

Научная публикация

Случайная публикация

Обратная связь

ТОР 5 статей:

Методические подходы к анализу финансового состояния предприятия

Проблема периодизации русской литературы ХХ века. Краткая характеристика второй половины ХХ века

Ценовые и неценовые факторы

Характеристика шлифовальных кругов и ее маркировка

Служебные части речи. Предлог. Союз. Частицы

КАТЕГОРИИ:






Выделение, очистка и концентрирование продуктов ферментации




Выделение внутриклеточных продуктов ферментации часто требует предварительной дезинтеграции клеток, т.е. разрушения клеточных оболочек, что осуществляется одним из следующих методов:

- физическими: механическим измельчением, замораживанием и продавливанием, ультразвуковым воздействием, «паровым взрывом» (декомпрессия);

- химическими – гидролиз под действием реагентов и/или температуры;

- ферментативными методами: ферментолизом – воздействием гидролитических (липолитических, протеолитических) ферментов на клеточную стенку; автолизом, являющимся разновидностью ферментолиза с использованием собственных ферментов клеток, и вызываемым шоковыми воздействиями на клетку.

Процессы выделения, концентрирования и очистки внеклеточных продуктов ферментации из культуральной жидкости носят небиологический характер и относятся к физико-химическим процессам:

- жидкостная экстракция (экстрагентами являются хлороформ, хлорметан, бутилацетат и др.;

- твердфазная экстракция (из биомассы микроорганизмов);

- кристаллизация и перекристаллизация для перевода растворенного продукта в нерастворенное состояние (кристаллы) при охлаждении раствора;

- адсорбция;

- ионный обмен;

- отгонка, ректификация;

- хроматография;

- диализ и обратный осмос для отделения высокомолекулярных соединений от низмомолекулярных через полупроницаемые мембраны;

- микрофильтрация и ультрафильтрация.

 

Выделение большинства продуктов ферментации из культуральной жидкости, а также их очистка и концентрирование осуществляется по одной из четырех типовых схем (рис. 19).

Рисунок 19 – Типовые схемы выделения, очистки и концентрирования продуктов ферментации

 

Схема 1 является наиболее простой и служит для получения неочищенных продуктов ферментации для нужд сельского хозяйства и животноводства. Пример: получение товарного продукта антибиотика хлортетрациклина. Его кальциевая соль осаждается из культуральной жидкости при рН>7. Осадок, содержащий клетки гриба-продуцента, внутриклеточный витамин В12 и внеклеточный антибиотик, фильтруют, высушивают, измельчают с добавлением отрубей в качестве наполнителя и фасуют.

Схема 2 предназначена для получения биомассы: живой (пекарских дрожжей, бактериальных удобрений), ослабленной (вакцин), инактивированной (БОО). Пример: для отделения и концентрирования биомассы кормовых дрожжей последовательно применяют следующие методы: флотацию, центробежную сепарацию, вакуум-выпаривание. Далее концентрат дрожжевой биомассы сушат с грануляцией биомассы.

Схема 3 используется для получения эндометаболитов. Выбор методов выделения зависит от свойств метаболитов. Примеры: полиеновые антибиотики успешно экстрагируются органическими растворителями из нативных клеток, а эндоферменты получают из разрушенных (дезинтегрированных) клеток (перепадом давления, УЗИ, ферментолизом).

Схема 4 применяется для получения и очистки экзометаболитов. Выделение начинают при их накоплении в культуральной жидкости около
1,5 % (мас.).

Предварительная обработка необходима для повышения эффективности фильтрования бактериальных суспензий и суспензий актиномицетов, но необязательна для суспензий микромицетов. Для предобработки микробных суспензий используют обработку коагулянтами (FeCl3, Al2(SO4)3, Na2SiO3) и флокулянтами (ПАА-гель, ПАВ) для агрегирования клеток.

Затем культуральную жидкость фильтруют с отделением биомассы, например, в вакуум-барабанных фильтрах.

Экзометаболиты экстрагируют из нативного раствора органическими растворителями, например, пенициллин – бутилацетатом. Выбор экстрагента определяется коэффициентом распределения (К) экстрагируемого вещества. Согласно закону Нернста он определяет соотношение концентраций извлекаемого вещества в экстрагенте и экстрактиве:

К = С в экстрагенте / С в экстрактиве

Для приведенного примера К=35 при рН=2,5 и t =0 0С.

 

Методы очистки индивидуальны в зависимости от типа экзометаболита.

Пример: выделение и очистка антибиотика канамицина ионным обменом:

1) выделение канамицина на катионитном ионообменном материале:

6 RCOONa + Кан6+ (RCOO)6Кан + 6 Na+

карбоксильный антибиотик

катионит КБ-2 на катионите

с дальнейшей десорбцией канамицина аммиачной водой:

(RCOO)6Кан + 6 NH4+ 6RCOONH4 + Кан6+

2) очистка канамицина на анионитном ионообменном материале АВ 17 2П для поглощения пигментных веществ. Канамицин не сорбируется на анионитах и остается в растворе, лишенном примесей;

3) дополнительная очистка на активированных углях марок БАУ или ОУ-А, Б, либо УАФ, УМФ;

4) кристаллизация метанолом (при рН 9,3-9,7);

5) центрифугирование кристаллов;

6) высушивание.

 

Лабораторная работа 4. Концентрирование и отделение микробной биомассы

 

Цель и задачи работы: исследовать эффективность концентрирования дрожжевой и бактериальной биомассы в процессе ее отделения от культуральной жидкости различными методами.

Объекты исследования и реактивы:

- микробные суспензии в объеме 500 мл каждая, полученные в результате предварительного суточного культивирования: дрожжей Sacch. сerevisiae и бактерий (например, E. coli).

- растворы флокулянтов (фталоилжелатина, полиакриламид), 1 % (масс.)

- растворы коагулянтов (сульфат алюминия, хлорид железа (III)), 0,5 % (масс.).

 

Лабораторное оборудование и посуда:

- фотоэлектроколориметр (2 шт.) и кюветы с толщиной рабочего слоя 5 мм

- центрифуга (скорость вращения 1000-8000 об/мин)

- микрокомпрессоры для барботажной флотации, двухканальные, двухрежимные (2 шт.) с аэрационными устройствами (фильтросными патрубками)

- мерные цилиндры объемом 100 мл (по 2-4 шт.)

- стеклянные стаканчики (4 шт.)

- воронки (4 шт.)

- пробирки с резиновыми пробками

- пипетки объемом 1, 2, 5, 10 мл (каждая – 1-4 шт.).

- фильтровальная бумага или фильтры (белая лента)

Задание (рассчитано на его выполнение 4-мя бригадами):

пункты задания предлагается выполнять в следующей последовательности:

1 бригада: 1-3-2-4;

2 бригада: 4-3-1-2;

3 бригада: 3-4-1-2;

Бригада: 1-3-4-2.

1. Разделение микробных суспензий отстаиванием

Разлить дрожжевую суспензию (по 10 мл) в 2 пробиркию. Аналогично разлить бактериальную суспензию по двум пробиркам. Измерить исходную оптическую плотность образцов дрожжевой и бактериальной суспензий в пробирках (перед измерением хорошо перемешать, измерять трижды, результаты измерений усреднить!).

Внести пипеткой 1 мл раствора флокулянта и/или коагулянта в одну пробирку с дрожжевой суспензией и в одну – с бактериальной. Хорошо перемешать все четыре пробирки. Установить пробирки в лабораторный штатив, отметив время начала отстаивания. По истечении 15 и/или 30 минут проанализировать эффективность отстаивания суспензий в пробирках с флокулянтом/коагулянтом в сравнении с пробирками без реагентов. Для этого измерить оптическую плотность верхнего слоя суспензии во всех четырех пробирках (отбирать суспензию следует пипеткой или капельницей осторожно, без перемешивания содержимого пробирок!).

2. Разделение микробных суспензий фильтрованием

Профильтровать образцы суспензий из всех четырех пробирок; при этом отмечать объем фильтрата, образующийся за определенное время. Далее следует измерить оптическую плотность всего количества накопленного фильтрата. Сделать вывод об эффективности фильтрования дрожжевой и бактериальной суспензий, предварительно обработанных и необработанных флокулянтом и/или коагулянтом.

3. Разделение микробных суспензий флотацией

Для концентрирования биомассы в результате ее отделения от культуральной жидкости методом барботажной флотации следует выполнить следующее:

два одинаковых лабораторных стаканчика, установленных в чашки Петри (без крышек), наполнить до края микробными суспензиями (один из стаканчиков – для дрожжевой суспензии, другой – для бактериальной). Измерить оптическую плотность образцов суспензий. Поместить на дно стаканчиков аэраторы микрокомпрессоров. Установить режим малого расхода воздуха микрокомпрессоров. Включить компрессоры и аэрировать суспензии до прекращения выхода пены из стаканчиков и чашки Петри (обычно это занимает не более 5-10 минут). Далее следует установить режим большего расхода воздуха с целью дополнительной флотации микробных клеток и выноса их с пеной в чашку Петри (это требует еще 5-7 минут аэрации).

Затем требуется измерить оптическую плотность культуральной жидкости в стаканчиках и сделать вывод об эффективности флотационного отделения дрожжей и бактерий от культуральной жидкости.

4. Центробежное сепарирование микробных суспензий

Для этого потребуются два одинаковых центрифужных стаканчика: один из них следует наполнить дрожжевой суспензией, другой – бактериальной. Измерить исходную оптическую плотность образцов дрожжевой и бактериальной суспензий в стаканчиках (перед измерением хорошо перемешать, измерять трижды, результаты измерений усреднить!).

Сепаририровать биомассу в поле центробежных сил при 4000 об/мин в течение 15 минут. (Внимание: стаканчики равного объема располагать в центрифуге попарно только друг против друга!)

Определить оптическую плотность надосадочной жидкости.

Дополнительно сепарировать биомассу при 8000 об/мин в течение следующих 15 минут.

Снова определить оптическую плотность надосадочной жидкости.

Сделать выводы об эффективности центробежного метода сепарирования микробных суспензий.

В итоге проведенной работы следует сформулировать общее заключение об эффективности методов концентрирования дрожжевой и бактериальной биомассы в результате ее отделения от культуральной жидкости.

Подготовить отчет по выполненной лабораторной работе.

Вопросы к коллоквиуму

по теме «Концентрирование и отделение микробной биомассы»

 

1. Культуральная жидкость. Нативный раствор.

2. Виды продуктов ферментации по их месту в типовой технологической схеме.

3. Общая характеристика методов отделения биомассы от культуральной жидкости.

4. Типовая схема отделения клеточной биомассы от культуральной жидкости. Методы концентрирования биомассы.

5. Типовая схема и методы выделения и очистки эндометаболитов.

6. Типовая схема и методы выделения и очистки экзометаболитов.

7. Предварительная обработка культуральной жидкости для эффективной фильтрации микробных суспензий.

8. Фильтрование и осаждение микробных суспензий.

9. Центробежное сепарирование микробных суспензий.

10. Флотационное отделение микроорганизмов от культуральной жидкости.

 

 






Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

vikidalka.ru - 2015-2024 год. Все права принадлежат их авторам! Нарушение авторских прав | Нарушение персональных данных