ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ И МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ГИСТОЛОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

В основе окрашивания клеток и тканей лежат физико-химичес­кие процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др), происходящие как в красителе, так и в микрострукту­рах Большое значение имеют плотность ткани и дисперсность красителя, которые определяют последовательность и скорость

окрашивания.

Целью окрашивания является более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей. Некоторые красители обеспечивают этот эффект, растворяясь в выявляемых компо­нентах, например нейтральных жирах. Другие красители вызы­вают химическую реакцию, например выявление железа с обра­зованием берлинской лазури в кислой среде. Во многих случаях процесс окрашивания возможен только при наличии протравы, например гематоксилин окрашивает ткань в присутствии солей металлов.

В гистологической практике применяют основные, кислот­ные и нейтральные красители.

Основные, или ядерные, красители — это основания или их соли, которые окрашивают структуры кислой природы (хрома­тин ядер, ядрышко и др.) и называются базофильными. К ним относятся гематоксилин, тионин, кармин, метиловый зеленый и др.

Кислотные красители - это кислоты или их соли, с помо­щью которых выявляют вещества и структуры основной приро­ды (цитоплазматические структуры клеток, эритроциты и т.д.) Таковыми являются эозин, кислый фуксин, конго красный (конгорот), эритрозин. Нейтральные красители: судан III, судан IV, метиленовый синий.

Процесс гистологического окрашивания условно подразделяют на прогрессивный и регрессивный, прямой и непрямой, простой и сложный. При прогрессивном типе окрашивания процесс идет до тех пор, пока не достигается интенсивное проникновение красителя в ткань. Регрессивный тип основан на первоначальном перекрашивании структур с последующей дифференцировкой до нужного уровня. Если раствор красителя непосредственно действует на ткань, то говорят о прямом окрашивании.

Окрашивание после предварительной подготовки ткани называется непрямым. Окрашивание одним красителем – простое, а при использовании нескольких красителей – сложное.

Ядерные красители и их приготовление.

Окрашивание ядер клеток обусловлено двумя механизмами химического взаимодействия: 1) основные красители, например анилиновые, образуют соли в присутствии ДНК и РНК; 2)образуются комплексы с ионами металлов при применении протравы. В практической работе чаще используют протравные красители. К ним относятся гемотоксилин, кармин, сафранин, галлоцианин, ализарин. Хорошо окрашивают ядра такие красители, как янус зеленый, основной коричневый, оксазиновые красители (крезиловый фиолетовый, нильский голубой), тианин, азуры, метиленовый синий, основной фуксин, метиловый зеленый и др. (любая фотография гемотоксилина-эозина)

окраска кармином

Окраска сафранином

Цитоплазматические красители.

Окрашивание цитоплазмы клеток происходит в результате связывания оснований и белков кислотными красителями. В группу диффузных (кислых) красителей входят карбоновые и сульфоновые кислоты, нито-, азокрасители и др. В гистологической практике постоянно применяют эозины, пикриновую кислоту, оранжевый Г, кислый фуксин, конго красный (конгорот), азокармин, эритрозин.

Окраска Конго- Красный. Ткань почки

Окраска Азур II – Эозин

Основные гистохимические реакции.

Цель гистохимии как раздела гистологии и цитологии – микроскопическая локализация химических соединений в клетке и тканях при сохранении их структуры, а так же изучение механизмов и специфичности реакций, используемых с этой целью.

Результат гистохимического анализа в равной мере зависит от качества проведения гистохимической реакции и подготовки материала.

Гистохимия белков.

Белки принимают участие в построении практически всех структур клеток и тканей. Для гистохимии представляет интерес не подтверждение наличия белков в тех или иных клеточных и тканевых структурах, а оценка его содержания или установление класса белка.

Гистохимические методы выявления белка берут начало от классических реакций аналитической, органической и биологической химии. к ним относятся: реакция Милона на тирозин; топротеиновая реакция на фенольные производные; реакция Сакагуши на аргинин; нитропруссидная реакция и д.р.

Метод окислении над муравьиной кислотой для выявления дисульфидина по Пирсу.

Окраска ДНК и РНК метиловым зеленым – пиронином по Браше в модификации Курника

Гистохимия углеводов.

Биологическая роль углеводов многообразна. В организме они выполняют опорные и энергетические функции, некоторые углеводы являются составными частями биологически важных соединений(АТФ, цАМФ, нуклеиновых кислот, гипарина и витамина С. Гликопротеиды как специфический компонент иммуноглобулина играют важную роль в иммунных механизмах, определяя антигенную активность сывороточных и клеточных факторов. Кроме того, продукты расщепления углеводов используются дл синтеза практически всех классов соединений в живой клетке.

Реакция Шифф-йодной кислотой (ШИК-реакция для выявления альдегидов)

Гистохимия липидов.

Собирательный термин «Липиды» охватывает жиры и жироподобные вещества растительного и животного происхождения. Это преимущественно не полярные соединения, основным компонентом которых являются жирные кислоты. Липиды

нерастворимы или плохо растворимы в воде, но хорошо растворяется в типичных жирорастворителях: бензине, ацетоне, эфире, горячем спирте и тд.

Окраска суданом черным по Лизону

Гистохимия биогенных аминов.

Биогенные амины – низкомолекулярные органические основания – образуются в процессе декарбоксилирования и последующих ферментативных превращений аминокислот. С помощью гистохимических методов выявляют две группы биогенных аминов – катехоламины и индоламины. Их концентрация в большинстве органов низкая, поэтому для гистохимического выявления пригодны лишь высокочувствительные реакции. Биогенные амины в тканях выявляют с помощью хромаффинной и аргентаффинной реакции, реакций окрашивания и конденсации и других методических подходов.

Гистохимия Пигментов.

Термин «пигменты» охватывает группу веществ, поглощающих свет в видимом спектре и наблюдаемых в неокрашенных клетках и тканях. Под это определение подходят вещества различного происхождения, состава и функционального назначения. По происхождению пигменты можно разделить на экзогенные(угольная или известковая пыль, отложения металлов, химиотерапевтических веществ и др.) и эндогенные. Эндогенные пигменты разделяются на гематогенные(например, гемоглобин и его производные) и негематогенные, или аутогенные(например, меланин и жировые пигменты – липофусцины и каротиноиды).

В гистохимическом отношении пигменты мало различаются. Несмотря на то, что химический состав ряда пигментов выяснен не до конца, гистохимически их можно выявить с достаточно высокой степенью надёжности, тем более что большинство из них имеет характерную тканевую локализацию.

Желчные пигменты

пигменты меланина

белая жировая ткань

жир в клетках печени

зубная пульпа

импрегнация серебром нервное волокно

гранулы гемосидерина

Гемоглобин

выявления соединений трехвалентного железа

Гистохимия Ферментов.

В настоящее время известно около 1000 ферментов, но лишь около 100 из них доступны гистохимическому изучению. Вместе с тем информация, получаемая с помощью гистохимических методов, гораздо более ценная, чем это может показаться на первый взгляд. Во-первых, при изучении обмена веществ в конкретном типе клеток или ткани необязательно анализировать все или большинство ферментов, достаточно выявить ключевой фермент исследуемого цикла. Во-вторых, энзимогистохимические методы позволяют исследовать ферменты в тканях и клетках in situ, не подвергая их разрушению, связанному гомогенизацией, аутолизом, элюцией и резорбцией в процессе выделения, что может привести к ошибочной интерпретации результатов. С помощью гистохимических подходов удается обнаруживать ферменты не только на тканевом, но также часто на клеточном и субклеточном уровнях.

Основные принципы гистохимического выявления ферментов

В основе энзимогистохимических методов лежит выявление продукта ферментативной реакции. При этом, строго говоря, определяется не сам фермент, а его активность.

Гистохимическая реакция выявления ферментативной активности состоит из двух этапов – собственно ферментативной реакции и одновременной или последовательной реакции «захвата» с образованием окрашенного конечного продукта гистохимической реакции(нерастворимого хромогена) по следующей схеме: субстрат"первичный продукт реакции"реакция «захвата» "конечный продукт реакции(нерастворимый хромоген).

Все известные гистохимические реакции определения ферментативной активности можно разделить на реакции осаждения ионами металлов, окислительно-восстановительные реакции, индигогенные методы, реакции азосочетания, реакции со вспомогательными ферментами и реакции синтеза.

реакция на гликоген в гранулоцитах (диффузное окрашивание цитоплазмы)

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: