Метод проточной цитометрии: Общие принципы

В основе метода проточной цитометрии лежит измерение параметров каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии со скоростью до 3000 кл. в секунду. Суспензию предварительно окрашенных флуоресцирующими красителями (как правило, в роли красителей выступают моноклональные антитела, коньюгированные с флуоресцентной меткой) клеток под давлением прогоняют через капилляр. Клетки, подхваченные потоком жидкости, выстраиваются друг за другом, образуя "цепочку" - принцип гидродинамического фокусирования, благодаря которому создаются условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток с обтекающей жидкостью. Когда такую струю пересекает сфокусированный лазерный луч, в точке пересечения потока и луча одновременно оказывается, как правило, только одна клетка, что позволяет избежать артефактов, связанных с разной удаленностью клеток от точки пересечения лазерного луча с потоком. Высокочувствительные датчики, расположенные вблизи проточной ячейки, фиксируют рассеивание света под углом от 2 до 19°, которое называется прямым или малоугловым светорассеиванием (FSC) и под углом 90° - боковое светорассеивание (SSC). Одновременно с этим регистрируется излучение флюорисцентных меток (FL1, FL2, и т.д.), имеющее строго определенную для каждого красителя (флюорохрома) длину волны. Таким образом, анализ клеток производится по следующим основным параметрам: * FSC (forward side scatter) - показатель прямого светорассеяния, который характеризует размеры клеток. * SSC (side scatter) - показатель бокового светорассеяния, который отражает оптическую неоднородность цитоплазмы клеток, характер клеточных включений и гранулярность клетки. * FL1 – FL5 - каналы детекции специфического флуоресцентного сигнала красителя на разной длине волны. Использование нескольких флюоресцентных меток позволяет проводить одновременный двух-, трехцветный и более анализ (Cytomics FC 500, которым располагает ИнБЮМ позволяет работать одновременно с 5 метками), так как каждый флюорохром при прохождении через луч лазера испускает свет различной длины волны. Наиболее часто в качестве красящей метки применяется флюоресцеинизотиоционат (FITC), который улавливается FL-1-детектором (первый канал флюоресценции) (зеленый спектр), фикоэритрин (PE) - FL-2-детектором (желтый спектр), менее часто - тандем цианин - 5/фикоэритрин и пиридин хлорофилл (PerCp, Cy5/PE) - FL-3-детектором и аллофикоцианин (APC) - FL-4-детектором.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: