ПРОМЫШЛЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ И КЛЕТОК

Сочетание уникальных каталитических свойств энзимов с пре­имуществами иммобилизованных ферментов и клеток как гетерогенных катализаторов позволило создать новые промышленные техноло­гические процессы. Следует отметить, что почти все они относятся к производству пищевых продуктов и лекарственных препаратов.

В настоящее время в мире разработаны следующие крупномас­штабные производства с использованием иммобилизованных фер­ментов и клеток:

1. Получение глюкозофруктозных сиропов.

2. Получение оптически активных L-аминокислот из их раце­мических

смесей.

3. Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония.

4. Синтез L-аланина из L-аспарагиновой кислоты.

5. Синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты.

6. Получение безлактозного молока.

7. Получение сахаров из молочной сыворотки.

8. Получение 6-аминопенициллановой кислоты.

В качестве примера рассмотрим некоторые из них.

1. Получение глюкозофруктозных сиропов. Фруктоза (фруктовый, плодовый или медовый сахар) - важнейший в физиологическом и технологическом отношении природный моносахарид. Превра­щаясь в печени и кишечнике млекопитающих в глюкозу, фрукто­за включается в пластический и энергетический обмен клетки. Она в 2,5 раза слаще глюкозы и в 1,7 раза слаще тростникового сахара (сахароза), благодаря чему фруктоза - менее калорийный пищевой продукт по сравнению с последними. В отличие от глюкозы обмен фруктозы не контролируется инсулином, поэтому фруктозный сахар может потребляться больными диабетом. Фруктоза прак­тически не вызывает кариеса зубов. В смеси с глюкозой фруктоза не кристаллизуется, поэтому широко используется для производ­ства кондитерских изделий.

Объем производства сахарозы за последние 100 лет возрос в 15 раз и составляет, по разным оценкам, 30 - 40 кг в год на человека. Однако, несмотря на явные преимущества использования фрук­тозы, первая промышленная установка для превращения глюко­зы во фруктозу с помощью иммобилизованной глюкоизомеразы была запущена лишь в 1973 г. (компания «Клинтон Корн», США). Исходным сырьем для этого процесса служит глюкоза, которую получают при гидролизе кукурузного или картофельного крахма­ла в присутствии минеральных кислот. Для конструирования про­мышленного биокатализатора глюкозоизомеразу сорбируют на пористых неорганических носителях или ионообменных смолах. Во многих случаях используют иммобилизованные клетки разно­го происхождения (Aspergillus niger, A. oryzae, Streptomyces phaeochro-mogenes, S. olivaceus, S. venezuelae). Коммерческие препараты им­мобилизованной глюкоизомеразы имеют вид гранул, шариков, волокон или аморфной массы. Наиболее эффективными биореак­торами для получения фруктозы признаны аппараты колонного типа высотой около 5 м, в которых по сравнению с реакторами перемешивания расход фермента минимален. Производительность такого реактора варьирует от 600 до 9000 кг глюкозофруктозного сиропа на 1 кг иммобилизованного фермента в зависимости от чистоты исходного сырья, а время полуинактивации катализато­ра - 20 - 50 суток. Возникающий в результате каталитического процесса глюкозофруктозный сироп содержит 42 —45 % фрукто­зы, около 51 % глюкозы, небольшое количество олигосахаридов и по сладости соответствует инвертному сахару, получаемому при гидролизе сахарозы. Эти смеси постепенно вытесняют инвертиро­ванный сахар в промышленности и медицине. Глюкозофруктозную смесь широко применяют для производства тонизирующих напитков, консервированных фруктов, кондитерских изделий, хле­ба, мороженого и пр. Экономические расчеты показали, что про­изводство глюкозофруктозных сиропов с использованием иммо­билизованной глюкоизомеразы в 1,5 раза выгоднее получения са­харозы из сахарной свеклы по традиционной технологии. Благо­даря этому обстоятельству производство глюкозофруктозных си­ропов в мире постоянно растет. Так, в 1980 г. 10 % потребляемого населением Японии сахара заменено на глюкозофруктозную смесь. В США эта доля к 2000 г. достигла 40%, а к 2010 г. более 50%.

2. Биотрансформация других углеводов. Кроме изомеризации углеводов, важную роль также играют процессы микробиологической окислительной и восстановительной трансформации углеводов. Окислительная трансформация представляет собой окисление полиолов, например, маннита во фруктозу или сорбита в сорбозу. Окисле­нию подвергаются все полиолы (полиспирты), обладающие двумя вторич­ными гидроксилами в цис-положении, прилежащими к терминальной пер­вичной спиртовой группе, причем окисляется атом углерода, смежный с терминальным. Окисление полиолов получило название кетогенной фер­ментации.

В промышленном масштабе (при использовании свободных клеток) применяются два процесса окисления полиолов: превращение глицерина в диоксиацетон и превращение D-сорбита в L-сорбозу (одна из стадий синте­за аскорбиновой кислоты).

Диоксиацетон (1.3-дигидрокси-2-пропанон) используется для обра­ботки изделий из целлюлозных волокон для придания им несминаемости, устойчивости к стирке и прочих важных эксплуатационных свойств; слож­ные эфиры диоксиацетона являются репеллентами; из диоксиацетона и аминокислот синтезируют пищевые и косметические красители; производ­ные диоксиацетона применяют как консерванты, эмульгаторы, пластифи­каторы, фунгициды; наконец, диоксиацетон широко используют в медици­не.

Для промышленного производства диоксиацетона применяется куль­тура Acetobacter suboxydans (НПО "Биолар"). Известны лабораторные ме­тоды реализации процесса с помощью иммобилизованных клеток (как А. suboxydans, так и Cluconobacter oxydans), когда иммобилизацию проводят в ПААГ или Са-альгинате.

Окисление D-сорбита в L-сорбозу в промышленных условиях также осуществляют с помощью клеток А. suboxydans или G. suboxydans. L-сор­бозу получают с 93%-ным выходом из 15-20 %-ных растворов D-сорбита в аэробных условиях.

В лабораторных условиях окисление D-сорбита в L-сорбозу проводят с помощью бактерий, иммобилизованных включением в каррагинановый гель, а также в ПААГ. Осуществлено также окисление иммобилизован­ными клетками рибита и маннита в соответствующие кетоны. Следует, од­нако, отметить существенное снижение скорости окислительных процессов при использовании иммобилизованных в гель клеток по сравнению со сво­бодными.

Восстановительная трансформация углеводов заключается в превра­щении альдоз или кетоз в полиолы. Промышленно значимым является процесс получения ксилита из ксилозы, поскольку ксилит используется в пищевой промышленности и служит заменителем сахара. Для восстанов­ления ксилозы применяют дрожжи C.utilis, которые были иммобилизованы в ПААГ.

Еще один класс реакций, касающийся углеводов и приводящий к по­лучению полезных продуктов, представляют гидролитические реакции. Важную роль играют следующие процессы: гидролиз лактозы, сахарозы, раффинозы и целлобиозы.

Гидролиз лактозы с получением глюкозы и галактозы и гидролиз са­харозы с получением глюкозы и фруктозы являются хорошими примерами биотехнологических процессов, основанных на использовании иммобили­зованных биокатализаторов, внедренных в широком масштабе. Лактоза содержится в молоке и молочной сыворотке, причем определенная часть населения не может употреблять молоко именно из-за наличия в нем лак­тозы, но усваивает (без аллергических эффектов) безлактозное молоко. Гидролиз же лактозы в молочной сыворотке, содержащей около 5% лак­тозы в жидкой и около 75% в высушенной сыворотке, открывает новые возможности получения сахаристых веществ из нетрадиционного сырья.

Следует отметить, что технология гидролиза лактозы основана на применении иммобилизованных грибных или дрожжевых ферментов b-лактозидаз, в частности опытные и опытно-промышленные установки существуют в РФ, США, Англии, Франции. Тем не менее, уже созданы и промышленные установки для гидролиза лактозы с помощью иммобилизованных клеток, обладающих b-галактозидазной активностью. Одна из них разработана фирмой “NOVO” (Дания). В ней используются клетки Bacillus sp., иммобилизованные за счет поперечной сшивки глутаровым альдегидом. В лабораторных условиях иммобилизацию проводили с помощью адсорбции на полифениленоксиде (Caldariella acidophila), включением в ПААГ, агар, волокна коллагена (Е.alcalescens, E.coli, K.lactis, L.bulgaricus), адсорбцией на полиуретанах, стекле, поликарбонате, полистироле, хитозане (K.lactis).

Инвертный сахар (почти эквивалентную смесь глюкозы и фруктозы) получают из сахарозы с помощью иммобилизованного фермента инвертазы на уровне пилотных установок в РФ и США (компания Snam Progesty). В настоящее время существуют лабораторные разработки по получению биокатализаторов в виде иммобилизованных в ПААГ, или желатине дрожжей (S.cerevisiae), не уступающие по эффективности иммобилизованным ферментам.

Раффиноза, или галактозилсахароза, является наиболее распространенным после сахарозы олигосахаридом, встречающимся в свободном виде в сахарной свекле и других растениях (при ферментативном гидролизе раффинозы образуется галактоза и сахароза). Американская компания Great Western Sugar использовала в технологии иммобилизованный биокатализатор, представляющий собой клетки Vortierella vinacea, сшитые глутаровым альдегидом, обладающие a-га­лак­то­­зидазной активностью.

Гидролиз целлобиозы осуществлен иммобилизованными в Са-альгинате микроорганизмами с целлобиазной активностью. Этот биокатализатор может быть использован, например, при реализации процессов ферментативного осахаривания целлюлозы, когда гидролизат содержит целлобиозу.

К микробным продуктам, синтезируемым в больших количествах, относятся полисахариды - декстраны, леваны, маннаны, ксантаны. Декстраны продуцируются при использовании сахарозы в качестве субстрата бактериями Leuconostoc mesenteroidis, обладающими декстрансахарозной (или транс-глюкозидазной) активностью. Молекулы декстранов построены из остатков глюкозы с a-1.6-связью, имеют небольшое количество ветвлений, частично гидрализованные декстраны с молекулярной массой 40-80 тыс. служат заменителями плазмы крови, модифицированные декстраны также используются в медицине, поперечно-сшитые декстраны (сефадексы) применяются в качестве молекулярных сит для гельфильтрации.

Ксантаны - это смолы, синтезируемые Xanthamonas campestis при анаэробном росте на глюкозной среде. Ксантаны представляют собой разветвленные полимеры, состоящие из остатков глюкозы, маннозы и глюкуроновой кислоты, некоторые из которых имеют ацетильную (СН3СО) или пируватную (СН3СОСО) группы. Ксантаны добавляют ко многим пищевым продуктам в качестве загустителей и стабилизаторов, используют как красители в текстильной промышленности и полиграфии, в производстве косметических и фармацевтических препаратов, а также при бурении нефтяных скважин в качестве добавки к буровому шламу, поскольку они обладают свойствами ПАВ.

Для получения микробных полисахаридов используют, как правило, свободные клетки, однако имеется опыт применения и иммобилизованных клеток. Иммобилизацию проводят адсорбцией на полиуретане, песке, активированном угле, силохромах. Установлено, в частности, что целесообразно осуществлять синтез полисахаридов в условиях периодической смены среды (азотсодержащей и безазотистой). Введение безазотистой среды приводит к дополнительному закреплению клеток на носителе, так что они длительное время сохраняются в адсорбированном состоянии, однако, биосинтетическая активность клеток при этом снижается. При введении в реактор азотсодержащей среды сохраняется жизнеспособность клеток и восстанавливается уровень биосинтеза. В случае биосинтеза полисахаридов иммобилизация путем адсорбции более целесообразна, чем включением в гели, однако при адсорбционной иммобилизации велика вероятность десорбции клеток и смешивания их с целевым продуктом, причем в случае полисахаридов отделение целевого продукта от клеток затруднено. Поэтому метод, основанный на периодической смене сред играет в случае биосинтеза полисахаридов важную роль.

3. Получение L - аминокислот из их рацемических смесей. Наряду с микробиологическими способами важное значение имеют химические методы промышленного получения природных амино­кислот, в том числе незаменимых. Однако в результате химических реакций, используемых для синтеза аминокислот, содержащих асим­метрические атомы углерода, с одинаковой скоростью образуются как D-, так и L-стереоизомеры, т. е. всегда возникает рацемическая смесь. Между тем в живых клетках обмену подвергаются лишь L-аминокислоты. Разделение рацемических смесей на составляющие их оптические изомеры (представляющее труднейшую задачу) яви­лось первым промышленным процессом с использованием иммо­билизованных ферментов. Этот процесс был осуществлен в Японии в 1969 г. (компания «Танабе Сейяку») с помощью аминоацилазы, иммобилизованной на ДЕАЕ-целлюлозе. В качестве исходных соедине­ний в данном превращении используют N-ацилированные произ­водные D-,L-аминокислот, получаемые с помощью химического синтеза. Вследствие своей стереоспецифичности аминоацилаза гидролизует лишь N-ацил-L-стереоизомер, отщепляя от него ацильный радикал, в результате чего растворимость образующейся L-амино­кислоты резко возрастает и ее легко можно отделить от своего анти­пода физико-химическими методами. При нагревании оставшаяся N-ацил-D-аминокислота рацемизируется, т.е. превращается в ис­ходную смесь, которая вновь подвергается воздействию фермента:

Аминоацилаза строго специфична к структуре только ацильной части субстрата, поэтому одна и та же установка с иммоби­лизованным ферментом используется для получения различных аминокислот, в том числе L-валина, L-метионина, L-фенилаланина и L-триптофана. Время полуинактивации иммобилизованного энзима составляет 65 суток; на японских предприятиях он используется без замены более 8 лет и обеспечивает снижение стоимости производства аминокислот на 40 % по сравнению с тех­нологией, где применяются свободные молекулы фермента.

4. Получение L-аспарагиновой кислоты. Аспарагиновая кислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсластитель и подкислитель). Первая в мире промышленная установка для синтеза L-аспарагиновой кислоты из получаемого химичес­ким путем фумарата аммония была запущена в 1973 г. в Японии (фирма «Танабе Сейяку»); в ней использованы иммобилизован­ные в полиакриламидном геле клетки кишечной палочки Е. coli, содержащие аспартат-аммиаклиазу.

Полиакриламидный гель с иммобилизованными микробными клетками формуют в виде кубиков размером 2 - 3 мм, которыми заполняют колонку объемом 1 м³. Через колонку пропускают раствор фумарата аммония. При подкислении выходящего из ко­лонки элюата до рН 2,8 и охлаждении до 15⁰С из него выкристаллизовывается аспарагиновая кислота в виде препарата 100 %-ой чистоты. Процесс получения аспартата полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Производительность процесса - 1700 кг чистой аспарагиновой кислоты в сутки на |реактор. Иммобилизованные клетки кишечной палочки сохраня­ют активность фермента на 80 % в течение 120 дней и на 50 % в течение 600 дней работы реактора, в то время как свободные клетки — всего на протяжении 10 дней с уровнем активности 25 % от исходной. В

5. Получение L-аланина. В настоящее время основной промыш­ленный способ получения L-аланина - ферментативное декарбоксилирование L-аспарагиновой кислоты:

Процесс превращения L-аспартата в L-аланин катализируется аспартат-β-декарбоксилазой ряда микроорганизмов (Pseudomonas dacunhae, Alcaligenes faecalis, Achromobacter pestifier), иммобилизо­ванных в полиакриламидном геле, каррагинане или полиуретане. Установка, разработанная японской фирмой «Танабе Сейяку», производит этим способом 10 тонн аланина в месяц. Усовершенство­вание процесса связано с использованием в качестве сырья фума­рата аммония. В данном случае процесс получения L-аланина ста­новится двустадийным и реализуется в двух последовательно рас­положенных реакционных колонках. На первом этапе фумарат аммония превращается в L-аспарагиновую кислоту, которая без выделения из реакционной среды на втором этапе претерпевает β-декарбоксилирование с образованием аланина.

С помощью иммобилизованных клеток Serratia marcescens из треонина и глюкозы синтезируют L-изолейцин, а с помощью им­мобилизованных клеток Corynebacterium glutamicum - L-глутаминовую кислоту из L-глюкозы; L-триптофан - из индола; L-орнитин - из L-аргинина.

Таким образом расширение производства аминокислот стало возможным благодаря изменению технологии получения промышленных биокатализаторов и снижению затрат при их производстве.

6. Получение органических кислот. Органические кислоты и их соли широко используются в пищевой, фармацевтической, текстильной, кожевенной, химической, металлургиче­ской и других отраслях промышленности, поэтому их получение является важным направлением крупнотоннажного микробиологического синтеза. Многие кислоты можно производить как химическим, так и микробиоло­гическим путем, причем первый путь более предпочтителен, когда кислоты предполагается использовать для технических нужд, второй путь - для це­лей пищевой промышленности и медицины.

Источником углерода для микроорганизмов-продуцентов органиче­ских кислот являются углеводы, органические кислоты, спирты, алканы. Кислоты часто секретируются клетками, когда рост культуры в силу опре­деленных причин тормозится и переходит в стационарную фазу.

Фактором, вызывающим прекращение роста микробных культур, может быть недостаток минеральных компонентов или витаминов. В слу­чае получения органических кислот рост культур лимитируют источником азота, используя при этом избыточное количество источника углерода (и энергии). Интенсивный синтез кислот в стационарной фазе роста после исчерпывания дефицитного компонента продолжается до тех пор, пока в среде присутствует источник углерода и пока клетки продуцента жизне­способны. Это в принципе позволяет надеяться на широкое применение им­мобилизованных клеточных препаратов для получения органических ки­слот.

Хотя свойство продуцировать ту или иную органическую кислоту широко распространено среди микроорганизмов, на практике для полу­чения кислот используют специально отобранные или мутантные высоко­продуктивные штаммы, не синтезирующие побочных продуктов. В этих случаях выходы органических кислот - по существу, монопродуктов про­цесса - являются высокими: для молочной кислоты 90, глюконовой - 90-95, уксусной - 90-98, лимонной - 85%.

В настоящее время семь органических кислот производятся в про­мышленных масштабах, причем лимонную, глюконовую, кетоглюконо­вую, итаконовую и яблочную кислоты получают только микробиологиче­ским путем, а молочную и уксусную - химическим и микробиологическим методами.

Важнейшей для промышленности органической кислотой является уксусная. Она используется при производстве волокон, фармацевтических препаратов, инсектицидов, в пищевой промышленности, как субстрат для получения аминокислот. Микробиологический способ экономически оп­равдан в случае получения пищевого уксуса (окисление этанола ацетобак­териями). Производство столового уксуса (10%-ная кислота) составляет в мире 8-10 млн. м3в год. Техническую уксусную кислоту получают химиче­ским синтезом (карбонили-рование метанола).

В зависимости от способа иммобилизации (адсорбция на буковых стружках, TiO₂, ZrO₂, керамике, хлопке, ионообменных смолах, включе­ние в гели каррагинана, коллагена) продуктивность процесса варьирует в пределах 60 раз, концентрация уксусной кислоты изменяется от 20 до 110 г/л, операционная стабильность иммобилизованного биокатализатора дос­тигает 270 сут. Иммобилизованные на древесной стружке ацетобактерии применяются в промышленности; ряд биокатализаторов, полученных на основе использования других способов иммобилизации, успешно испытан в установках и реакторах пилотного масштаба.

Молочная кислота - первая из органических кислот, которую начали производить путем брожения, в конце XIX века было налажено промыш­ленное производство молочной кислоты при участии молочнокислых бак­терий (Lactobacillus debrueckii, L.Leichmanii и L.bulgaricus). Молочную ки­слоту используют в качестве добавки к пищевым продуктам, сокам, эссен­циям и напиткам, как окислитель в пищевой промышленности, в гальвано­стегии, а также при производстве пластмасс, когда L(+)форму кислоты по­лимеризуют в полилактат. Следует отметить, что практически вся произво­димая в США молочная кислота синтезируется химическим путем, в Ев­ропе половину ее получают при сбраживании глюкозы L.delbrueckii. Для интенсификации процессов получения молочной кислоты проводят иссле­дования по применению иммобилизованных молочнокислых бактерий, а также по оптимизации конструкции биореакторов.

Молочнокислые бактерии были иммобилизованы путем включения в различные гели. Для получения молочной кислоты предложено использо­вать мембранный реактор, колонный реактор с полыми волокнами, ко­лонный реактор с иммобилизованными включением в Са-альгинатный гель бактериями, соединенный с электродиализной ячейкой. Имеющиеся данные позволяют рассчитывать на 50-100-кратное увеличение производи­тельности процесса. Время полужизни иммобилизованного Са-альгенат­биокатализатора на основе L.delbrueckii составляет 100 сут.

Лимонную кислоту получают из мелассы с помощью микроскопиче­ских грибов Aspergillus niger. В 2000 г. ее мировое производство составило 175 000 т. Лимонная кислота применяется как ароматизирующее средство и консервант пищевых продуктов, для очистки и шлифовки металлов (хелатирующий агент), в качестве пластификатора лакокрасочных мате­риалов. Эфиры лимонной кислоты применяются при производстве пласт­масс. В лабораторных условиях иммобилизация А.niger проводилась в ге­лях Са-альгената, каррагинана, агара, полиакриламида, путем адсорбции на полипропиленовых пленках и пластинках, включением в поперечно-сшитую глутаровым альдегидом коллагеновую мембрану. Применение иммобилизованных клеток приводит к увеличению скорости образования лимонной кислоты в несколько раз, операционная стабильность иммоби­лизованного биокатализатора достигает 30 сут.

Лимонную и изолимонную кислоты получают с помощью дрожжей Candida sp. Изолимонная кислота синтезируется и при использовании Penicillium janthinellum (некоторые виды Penicillium синтезируют диастере­омер лимонной кислоты - аллозо-Ls -изолимонную кислоту). В лаборатор­ных условиях осущест-влена иммобилизация указанных микроорганизмов в Са-альгинат и ПААГ.

Хорошие результаты по технологическому применению иммобилизо­ванных клеток продемонстрированы при получении яблочной кислоты пу­тем микробиологической трансформации фумаровой кислоты. С 1974 г. японская фирма “Танабо Сеяку” приступила к промышленному выпуску яб­лочной кислоты с использованием включенных в ПААГ мертвых клеток Brevibacterium ammoniagenes. В 1978 г. ПААГ был заменен на каррагинан, что позволило в 2,3 раза увеличить эффективность биокатализатора, а за­мена В.ammoniagenes на В.flavum еще в 2 раза увеличила его эффектив­ность. В итоге появилась возможность с помощью однократно приготов­ленной партии иммобилизованного биокатализатора получить до 100 т яб­лочной кислоты (в настоящий момент производится 180 т). Продолжитель­ность функционирования иммобилизованных в полиакриламидный гель клеток составляет около 60 суток, в геле на основе каррагинана – до 160 суток против 6 суток для свободных клеток. Конверсия фумарата (1М) - до 70%, время одного трансформационного цикла - около 5 ч.

Глюконовая кислота и ее лактон являются продуктами окисления глюкозы. Промышленное производство глюконовой кислоты с помощью А.niger было налажено еще в начале 20-х годов. Выход процессов фермен­тации (свободные клетки) с получением глюконовой кислоты равен 95%, концентрация глюкозы - 150-200 г/л.

Глюконовая кислота находит применение как моющее средство, ее соли используются в медицине, а лактон - как подкислитель в пищевой промышленности. Производные глюконовой кислоты - 2-кетоглюконовую и 5-кетоглюконовую кислоты - получают с помощью микроорганизмов Pseudomonas sp., Gluconobacter sp., Acetobacter sp., причем процесс полу­чения 2-кетоглюконовой кислоты на основе свободных клеток нашел про­мышленное применение. Из 5-кетоглюконовой кислоты в результате хими­ческой гидрогенизации образуется L-идоновая кислота, а из нее осуществ­ляется ферментативный синтез 2-кетогулоновой кислоты, являющейся по­лупродуктом для производства аскорбиновой кислоты.

Иммобилизацию микроорганизмов-продуцентов глюконовой и 2-ке­тоглюконовой кислот проводят с помощью адсорбционных методов (при использовании в качестве адсорбентов нейлонового волокна, керамики, анионообменника амберлита), а также включением в гели каррагинана, Са-альгината, коллагена, ПААГ.

Наиболее эффективны биокатализаторы, полученные методами вклю­чения в упругие гели ПААГ или Са-альгината, при их использовании были реализованы процессы превращения глюкозы, концентрацией до 200 г/л с продуктивностью до 10 г/л×ч (по глюконовой кислоте), продолжительность функционирования иммобилизованных клеток достигала 200 сут.

Итаконовую кислоту, применяющуюся при производстве пластмасс и красителей, получают с высоким выходом из глюкозы с помощью грибов А.terreus (процесс на основе свободных клеток внедрен в промышленную практику в СССР). На лабораторном уровне проводилась иммобилизация А.terreus в ПААГ, а также путем адсорбции на сетчатых дисках из порис­той нержавеющей стали. В последнем случае использовался дисковый ре­актор: концентрация итаконовой кислоты достигала 20 г/л, реактор функ­ционировал без изменения продуктивности, которая составляла до 1 г/л.ч, до 30 сут.

7. Получение антибиотиков. Применение биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток позволило достичь больших успехов в области получения антибиотиков. Как важна область биотехнологии, связанная с синтезом антибиотиков, наглядно видно из стоимости мирового сбыта их четырех наиболее рас­пространенных групп (пенициллинов, цефалоспоринов, тетрациклинов и эритромицинов (имеется в виду продажа для медицины и ветеринарии): в 1978 г она составляла свыше 4 млрд. дол., в 1980 г. - около 7 млрд. дол., в 1985 г. - около 8 млрд. дол. (объем производства превысил 60 тыс. т в год), в 2000 г. более 20 млрд. дол.

Важность и масштабы производства антибиотиков обусловлены их применением в медицине и ветеринарии как противомикробных и проти­воопухолевых препаратов. С их помощью контролируется рост растений и ведется борьба с болезнями.

Новые поколения синтетических антибиотиков представляют собой сложные по химическому строению вещества, поэтому методы получения на основе полного химического синтеза не могут конкурировать с метода­ми, в которых используются микроорганизмы. Шесть родов филаментоз­ных грибов синтезируют около тысячи различных антибиотиков, в том числе цефалоспорины и пенициллины. Два рода нефиламентозных бакте­рий синтезируют 500 видов антибиотиков, а три рода актиномицетов - около 3 000 видов. Число известных антибиотиков увеличивается на не­сколько сотен каждый год.

Начиная с середины 60-х годов исследователи перешли от поиска но­вых антибиотиков к модификации структуры уже имеющихся. Особенно это было характерно для пенициллинов и цефалоспоринов, структура которых включает b-лактамное кольцо. Химическая модификация b-лактамного кольца ("добавление" к нему какой-либо химической группы) позволяет получить новые виды антибиотиков; их называют полусинтетическими.

Ключевым полупродуктом для получения полусинтетических антибиотиков пенициллинового ряда является 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК)

Получение 6-АПК в промышленности путем химического гидролиза бензилпенициллина сопряжено с большими трудностями в связи с крайней неустойчивостью лактамного цикла его молекулы. Так, при щелочном гидролизе бензилпенициллина выход 6-АПК составляет всего 1 %. Продуктивность этого процесса удалось значительно повысить благодаря применению для гидролиза иммобилизованных бактериальных клеток, содержащих пенициллинацилазу.

Со второй половины 70-х годов XX в. вся 6-АПК, выпускаема в СССР, и значительная часть 6-АПК, получаемая в Италии производились с помощью иммобилизованных ферментов.

На итальянских фирмах применяют фермент, иммобилизованный путем включения клеток Е. coli в волокна триацетата целлюлозы, на российских предприятиях используют бактериальные клетки, иммобилизованные в полиакриламидном геле. Переход к технологии, применяющей иммобилизованные бактериальные клетки обеспечивает высокий выход 6-АПК, составляющий 80-85%. По данным японских исследователей, время полуинактивации пенициллинацилазы, содержащейся в иммобилизованных в полиакриламидном геле бактериальных клетках, равно 42 суткам при 30°С или 17 суткам при 40⁰С.

Внедрение в промышленность биокаталитической технологии производства 6-АПК привело к существенному увеличению выпуска полусинтетических пенициллинов и снижению их себестоимости.

Для получения промышленных биокатализаторов с целью трансфор­мации антибиотиков используют иммобилизацию клеток микроорганизмов путем включения в ПААГ, сшитый глутаровым альдегидом желатиновый гель, связывание с глицидилметакрилатом с помощью глутарового альде­гида. По существу при трансформации антибиотиков из всего многообразия ферментов клетки используется лишь один из них. Сохранять жизнеспо­собность клеткам при этом не обязательно, активность катализатора можно увеличивать за счет разрушения клеточных оболочек, служащих диффузионными барьерами на пути субстрата к ферменту.

Тем не менее, простота требований, предъявляемых к системе, когда при иммобилизации нет необходимости сохранять жизнеспособность кле­ток, является кажущейся. В частности, простое включение в гель клеток E.coli приводит к быстрой инактивации биокатализатора вследствие вы­мывания фермента в процессе получения геля. В связи с этим был разрабо­тан способ включения в ПААГ клеток, предварительно модифицирован­ных в растворе мономеров путем сшивки бифункциональным реагентом.

При включении клеток E.coli в гели альгината по стандартной мето­дике их содержимое конкурирует с полимером за связывание с ионами кальция. Результатом является лизис клеток, нарушение интактности кле­точных структур. Стабильность такого биокатализатора иллюстрируют катализаторы фирмы “Спофа”, полученные на основе разрушенных клеток E.coli.

Резкого повышения стабильности удается достичь после "фиксирующей" модификации поверхности клеток до их контакта с рас­твором, содержащим ионы кальция. Эта фиксация резко меняет картину ультраструктуры иммобилизованных клеток, их удается сохранить струк­турно неизмененными.

Мягкое воздействие на клетки E.coli органическими растворителями, замещающими часть воды в клетке, приводит к изменению проницаемости клеточной стенки, увеличению доступа субстрата к внутриклеточным фер­ментам и ускорению вывода продукта при одновременном сохранении це­лостности покровов клетки, и, как следствие, активность биокатализатора и его стабильность существенно возрастают. Воздействие на клетки в про­цессе выращивания (температурный фактор, химические агенты) также по­зволяет получить микроорганизмы с повышенной проницаемостью кле­точных оболочек. Активность и стабильность иммобилизованного биока­тализатора на основе таких клеток возрастает.

Для иммобилизации микроорганизмов, осуществляющих биосинтез антибиотиков, применяют разные методы - включение в ПААГ, гели Са-альгината, каррагинана, агара, коллагена, включение в полые волокна, адсорбция на цеолите, пенополиуретане, поликарбонате, нейлоне, поли­сульфоне, стали. Биосинтез антибиотиков с помощью иммобилизованных клеток не имеет пока промышленного значения, но исследования в этом направлении интенсивно развиваются.

8. Трансформация стероидов. Одна из первых работ, посвященных иммобилизованным клеткам, касалась трансформации стероидов (в ней шла речь о гидроксилировании стероида кортексолона). В настоящее время все основные энзиматические процессы, используемые в стероидной химии, осуществлены с помощью иммобилизованных клеток: 1.2-дегидрирование, 11-a- и 11-b-гидрокси-лиро­вание, стереоспецифическое 17-b-восстановление, 20-a- и 20-b-восстановле­ние, дезацетилированние, трансформация стеринов и некоторые другие. Острая необходимость применения для трансформации иммобилизованных клеток обусловлена тем, что стереотрансформирующие ферменты, особен­но гидролазы и гидрогеназы, являются весьма лабильными, их выделение и очистка затруднены. Иммобилизованные клетки могут служить в этих случаях "носителем" активных и стабильных полиферментных систем, ре­генерирующих необходимые им кофакторы.

Промышленный синтез многих лекарственных препаратов на основе стероидов стал возможен с развитием методов микробиологической трансформации. В качестве сырья для промышленных процессов исполь­зуют природные стерины, выделяемые из растений или различных органов животных.

Трансформацию стероидов осуществляют с помощью различных микроорганизмов, для иммобилизации которых предложен широкий круг методов.

Максимальная стабильность и активность в непрерывном (проточном) реакторе наблюдается у клеток, адсорбированном на кера­мическом носителе, в условиях периодического реактора - у клеток, вклю­ченных в ПААГ. В случае иммобилизации в ПААГ период полуинактива­ции составил 5 мес. (160 циклов трансформации) при сохранении 95%-ного превращения гидрокортизона в преднизолон. Практически во всех носите­лях (кроме каррагинана) дегидрогеназная активность сохраняется на уров­не активности свободных клеток, причем клетки в иммобилизованном со­стоянии остаются жизнеспособны.

Трансформация стероидов является одним из примеров реализован­ных в промышленности процессов, основанных на использовании иммоби­лизованных клеток.

В настоящее время интенсивно разрабатываются методы использова­ния нерастворимых микрокристаллических стероидных субстратов для им­мобилизованных клеток. В этих случаях применяют диспергирование и из­мельчение субстрата, а также превращение его в водорастворимое состоя­ние (с помощью циклодекстринов). Предложен также новый метод про­ведения реакций, как для свободных, так и для иммобилизованных клеток и в двухфазных водно-органических системах. Клетки при этом локализо­ваны в водной фазе (внутри гранул носителя) и мало подвержены воздей­ствию органического растворителя, не смешивающегося с водой.

В качестве катализатора реакции дегидрирования стероидов в среде бензола и гептана используются различные виды бактерий Nocargia sp., иммобилизованные в гидрофобном носителе. Бактерии, включенные в гидрофобные гели (уретановые полимеры), обладают большей активно­стью и стабильностью, чем находящиеся в гидрофильном окружении, что определяется характером распределения субстрата между гелем и окру­жающим растворителем.

Наконец, следует отметить еще одну возможность утилизации нерас­творимого стероидного субстрата, когда клетки и частицы субстрата од­новременно включают в гранулы геля (альгината, агара, агарозы). После осуществления цикла трансформаций гранулы геля разрушают, клетки удаляют центрифугированием и рециклизуют, а продукт (преднизолон) экстрагируют из супернатанта органическими растворителями.

9. Получение ферментов. С точки зрения применения иммобили-зованных клеток речь может идти в первую очередь о получении внеклеточных ферментов (производство в мире составляет сотни тысяч тонн в год), среди которых промышленно важными являются амилазы, целлюлозы, гемицеллюлазы, пуллуланазы, декстраназа, пектиназы, лактаза, липазы, протеазы. Внутри-клеточные ферменты - глюкозооксидазу, каталазу, аспарагиназу, пенницилин-ацилазу, инвертазу, b-галактозидазу, глюкозоизомеразу, выделение которых требует разрушения клеточной стенки микроорганизма-продуцента, получать с помощью иммобилизованных микроорганизмов нецелесообразно.

По существу, из трех классических методов культивирования микро-организмов - на жидких питательных средах (глубинный), на твердых питатель-ных средах (поверхностный) и непрерывное культивирование - два последних можно с определенными оговорками отнести к методам, связанным с применением иммобилизованных клеток, которые закреплены на нерастворимом субстрате (источнике углерода) или отделяются от целевого продукта для последующего использования (рециклизуются).

10. Применение иммобилизованных клеток для утилизации отходов. Утилизация разнообразных органических отходов, жидких стоков различных отраслей промышленности, сельского хозяйства, бытовой деятельности человека является чрезвычайно злободневной и острой проблемой, вклад в решение которой биотехнологических (микробиологических) методов трудно переоценить. Большую роль в очистке воды играют микроорганизмы-деструкторы пестицидов, поверхностно-активных веществ, нефтяных загрязнений ксенобиотиков и т.д. Микробиологическая очистка сточных вод способствует также получению альтернативных энергоресурсов и сырья, поскольку продуктом обработки во многих случаях является биогаз (смесь метана и углекислого газа в соотношении 3: 1). Масштабы некоторых из биологических очистных процессов огромны: уже существуют биореакторы емкостью 4000-5000 м3и выше.

В основе биотехнологии очистки сточных вод лежат два подхода, в одном из которых используют аэробные, а в другом - анаэробные микроорганизмы. В аэробной очистке применяют активный ил (биопленку), представляющий собой скопление разнообразных микроорганизмов, видовой состав которых регулируется конкретными экологическими условиями. В большинстве случаев в развитых странах используют именно аэробную очистку.

Активный ил представляет собой темно-коричневые хлопья размером до сотен микрон, причем он состоит примерно на 70% из живых организмов и около 30% составляют частицы неорганической природы. Живые организмы вместе с твердым носителем, к которому они прикреплены, образуют так называемый зооглей-симбиоз популяций организмов, покрытый общей слизистой оболочкой. Зооглей может формироваться как за счет флокуляции, так и адгезии клеток на поверхности носителя. Микроорганизмы, входящие в состав активного ила, относятся к различным родам: Actinomyces, Actinobacter, Bacillus, Corynebacterium, Desulfiomaculum, Microcjccus, Pseudomonas, Sarcina и другие, которые окисляют спирты, жирные кислоты, парафины, ароматические углеводороды, нафтены, фенолы, осуществляют деградацию нефти (фенолы и формальдегид уже в незначительных концентрациях угнетают развитие микроорганизмов).

Аэробный способ очистки сточных вод основан на использовании системы из двух аппаратов: аэротенк и вторичный отстойник. Аэротенк - это открытое сооружение, через которое пропускается аэрируемая сточная вода и суспензия активного ила, в отстойнике же осуществляется доочистка воды. Применение активного ила по данной технологии относится, по существу, к методам, связанным с использованием иммобилизованных клеток. Однако кроме этого существуют промышленные методы использования активного ила, где иммобилизацию используют в "чистом" виде. Речь идет о биофильтрах, представляющих собой проточные емкости с принудительной или естественной циркуляцией, содержащие консорциум клеток активного ила, прикрепленных к поверхности пористого носителя, которым служит обладающая достаточной механической прочностью керамика, щебень, гравий, песок, керамзит, кольца Рашига, стекловолокно, нити синтетических волокон, металлические полимерные материалы.

Глубина и скорость очистки сточных вод в биофильтрах выше, чем в аэротенках (скорость в 10-15 раз выше и достигается практически полная очистка), однако содержание органики в очищаемых водах не должно превышать 500 мг/л (иначе трудно осуществить полную аэрацию биофильтра), кроме того, сточные воды перед биофильтром должны быть очищены от взвешенных частиц, в противном случае биофильтры быстро забиваются и происходит заиливание. Биофильтры целесообразно применять для очистки локальных стоков.

В последние годы конструкция биофильтров совершенствуется, например, в качестве носителя используют мелкозернистую полимерную или металлическую сетку. Биомассу клеток наращивают в пустотах внутри прокладок из пористого полиэфира, прокладки удерживают внутри реактора с помощью сеток и периодически удаляют из реактора. Густую биомассу отжимают, и пустые прокладки вновь возвращают в реактор. Запуск промышленных аэротенков и биофильтров в эксплуатацию занимает обычно десятки суток, время же их непрерывного функционирования составляет десятки месяцев.

Анаэробные способы очистки применяются, как правило, для обработки высококонцентрированных стоков и осадков, содержащих большое количество органических веществ. Процесс брожения осуществляется в метантенках. Анаэробное превращение органических веществ происходит под действием бактериальной микрофлоры (в ее состав входит до тысячи микроорганизмов) через четыре последовательных этапа: фаза гидролиза (расщепления) биополимерных молекул (белков, липидов, полисахаридов и других) на более простые, например, мономеры, аминокислоты, углеводы и другие; фаза ферментации мономеров до низших кислот и спиртов, аммиака, сероводорода; ацетогенная фаза (образование Н₂, СО₂, формиата, ацетата); непосредственно метаногенная фаза, которая ведет к конечному продукту расщепления - метану. Кроме метана, продуктом является углекислый газ (их смесь образует биогаз). В результате действия метанногенного консорциума микроорганизмов происходит резкое снижение концентрации органических загрязнений в отходах или сточных водах с одновременным образованием биогаза, который можно в дальнейшем использовать как энергоноситель или углеродный субстрат для синтеза микробной (кормовой) биомассы. Активное использование метаногенеза при сбраживании органических отходов является, по современным представлениям, одним из наиболее перспективных путей совместного решения экологических и энергетических проблем.

Конструкционное оформление метантанков весьма разнообразно, в общем случае это строго герметичный ферментер объемом до нескольких сотен кубометров с перемешиванием и рубашкой для обогрева, работающий в периодическом режиме загрузки отходов или сточных вод с постоянным отбором биогаза и выгрузкой твердого осадка по мере развития процесса. Обеспечение задержки (фиксирования) клеток в объеме метантенка при его работе и выгрузке позволяет значительно интенсифици­ровать процесс и увеличить выход биогаза.

Эффективность действия метантанков с иммобилизованными клетками в 2.5-3 раза выше, чем со свободными (во столько раз увеличивается выход биогаза с единицы объема метантенка), недостатком процессов с иммобилизованными клетками является то, что они приспособлены для переработки растворимой органики. С этой точки зрения метантенки с иммобилизованной биомассой чрезвычайно удобны для обработки сточных вод предприятий пищевой промышленности, например молокоперерабатывающих, спиртовых заводов, целлюлозно- бумажных производств и т.д. (их стоки не содержат значительного количества взвесей).

Важную роль в процессах очистки сточных вод играет денитрификация, осуществляемая, например бактериями Pseudomonas sp. Сущность денитрификации отражает схема:

NO3- + источник углерода ® N2 + CO2 + биомасса

Отдельной и важной задачей представляются процессы биодеградации сложных смесей углеводородов и их производных в средах, загрязненных нефтью. Сточные воды нефтяной промышленности обычно очищают биологическим способом или с помощью коагулянтов. Самые значительные утечки нефти происходят в море. Очистку морской поверхности от нефти проводят путем ее биодеградации природным симбиозом бактерий, способных расти на компонентах нефти и окислять их (конечными продуктами окисления являются СО₂ и Н₂О). Эти микроорганизмы действуют, по существу, в иммобилизованном состоянии на поверхности капель нефтепродуктов, причем, чем больше степень дисперсности нефти, тем быстрее осуществляется биодеградация. Наибольший эффект наблюдается, когда нефть эмульгирована в воде.

К числу острых экологических проблем относится проблема удаления из воды металлов (кадмия, свинца, цинка, урана, плутония), трития. Биотехнологический принцип решения этой проблемы состоит в применении иммобилизованных клеток микроорганизмов (бактерий) и микроводорослей, аккумулирующих металлы. Механизм процесса состоит в основном в комплексообразовании катионов металлов с функциональными группами клеточной стенки (натрием, фосфатными), в ион-ионном взаимодействии с заряженными группами, а также в адгезии частиц оксидов металлов (например, оксида урана) на поверхности клеток в результате электростатического взаимодействия.

Иммобилизацию клеток проводят адсорбцией на шариках из поливинилхлорида, полипропилена, цилиндрических частицах из стекла; включением в гели каррагинана, альгината, ПААГ.

Промышленные установки по извлечению металлов из сточных вод действуют в США и странах Евросоюза. Экономический эффект их использования очень значителен: применение 10 г клеток (сырая биомасса), иммобилизованных в альгинатный или каррагинановый гели при очистке сточных вод от трития, эквивалентно действию 1г платинового катализатора.

Некоторые микроорганизмы (мицелиальные грибы и бактерии, выделенные из золоторудных месторождений, а также дрожжи) способны к аккумуляции золота, которое в техногенных условиях встречается в элементарном состоянии, а также в виде ионов - Au+и Au3+. Адсорбируемое золото в некоторых случаях связывается с маннаном клеточной стенки.

Для практической реализации процессов удаления металлов из сточных вод (аккумулирования с целью концентрирования или выделения, например, урана из морской воды, золота) необходимо пропускать большие массы воды через колонные аппараты с иммобилизованными клетками, периодически меняя колонки или их содержимое; отделять клетки от носителя; выделять из них, если необходимо, металл т.д. Эта технология существенно упрощается, если использовать методы обратимой электроиммобилизации клеток.

Следует отметить, что с точки зрения технической микробиологии и биотехнологии биологическая очистка воды (в том числе с помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов) представляется необыкновенным процессом. Его необычность состоит в том, что обработке подвергается огромное количество воды. В развитых странах в сутки биологически очищается больше воды, чем вырабатывается в год таких крупнотоннажных продуктов, как сталь, молоко, пиво, сахар. В РФ биологически очищается сточных вод в год больше, чем добывается угля и нефти, производится чугуна, стали, цемента, зерна, вместе взятых, в течение пятилетки.

Очистка воды является тем чрезвычайно крупномасштабным процессом, где необходимость и возможность применения иммо­билизованных клеток полностью доказаны, причем реально может быть использован наиболее доступный тип иммобилизации - адсорбционный.

11. Биогеотехнология. Приложение биотехнологии к добыче, обога-щению и переработке руд и угля, отделению и концентрированию металлов, экстракции остаточных порций нефти из иссякающих месторождений относится к области биогеотехнологии.

Одним из направлений биогеотехнологии является получение металлов из бедных руд и производственных отходов. Традиционные способы извлечения металлов в таких случаях непригодны и не обеспечивают комплексное и рациональное использование руд и охрану окружающей среды.

В основе биотехнологии извлечения металлов из руд, концентратов, горных пород лежат химические процессы, осуществляемые микроорганизмами или их метаболитами: окисление сульфитных минералов, серы, Fe⁺², разложение силикатов. В большинстве случаев клетки микроорганизмов используют в иммобилизованном состоянии – в виде биопленки на поверхности частиц руды, горной породы или минералов.

Для выщелачивания металлов из сульфидных и смешанных руд и концентратов, из отходов пирометаллургического производства и для удаления серы из угля используют Thiobacillusferroxidans, Leptospirillum ferroxidans в ассоциации с Т.thiooxidans, T.organoparus. Микроорганизмы (грибы, бактерии, дрожжи) и их метаболиты используют для извлечения химических элементов из силикатных и карбонатных руд, для выщелачивания золота.

К процессам, непосредственно катализируемым бактериями, относятся окисление железа:

4FeSO₄ + O₂ + 2H₂SO₄ ® 2Fe₂(SO₄)₃ + 2H₂O

и окисление серы:

S₈ + 12O₂ + 8H₂O ® 8H₂SO₄

Ряд минералов окисляется некоторыми выщелачивающими микроорганизмами, например пирит:

4FeS₂ + 15O₂ + 2H₂O ® 2Fe₂(SO₄)₃ + 2H₂SO₄

и сфалерит:

ZnS + 2O₂ ® ZnSO₄

Ион трехвалентного железа служит сильным окисляющим агентом, переводящим в раствор многие минералы, например халькоцит:

CuS + 2Fe₂(SO₄)₃ ® 2CuSO₄ + 4FeSO₄ + S

и уранит:

UO₂ + Fe₂(SO₄)₃ ® UO₂ SO₄ + 2FeSO₄

Выщелачивание, происходящее при участии иона трехвалентного железа, который образуется в результате жизнедеятельности бактерий, называют “непрямой “ экстракцией.

В настоящее время бактериальное выщелачивание, известное как биогидрометаллургия или биоэкстрактивная металлургия, применяется в промышленных масштабах для перевода в растворимую форму меди и урана (выщелачивание отвалов и бедных руд). Бедную руду или отвальную породу перевозят из карьера в расположенную поблизости местность с естественным уклоном, который дает возможность собирать используемые растворы. Во- избежании загрязнения подпочвенных и поверхностных вод выбирают непроницаемые для воды участки. Для начала процесса выщелачивания отвал смачивают водой, подкисленной серной кислотой до рН=1.5–3.0. Кислый раствор просачивается сквозь руду и, поскольку он содержит углекислый газ и кислород, создает благоприятную среду для размножения природных ацидофильных тиобацилл. Из выщелачиваемых отвалов вытекают растворы, содержащие металлы, они направляются в отстойники, откуда извлекаются путем осаждения или экстракции, а отработанные выщелачивающие растворы вновь поступают в отвал.

Промышленное применение нашел также процесс удаления серы из угля. Предварительная обработка бактериями T.ferrоoxidans приводит к окислению значительной доли серы (в виде пирита) до серной кислоты (60-98% за 7-10 суток). Обработку угля проводят открытым способом, но ведется поиск методов введения микроорганизмов в пласты угля.

Закрепленные на поверхности раздела (жидкость-твердое тело и жидкость-жидкость) микроорганизмы применяют для увеличения добычи нефти. Традиционными методами можно извлечь из месторождений лишь часть ее, около 50% нефти остается в капиллярах пор породы месторождений.

Интенсификация добычи нефти осуществляется микроорганизмами и продуктами их жизнедеятельности. Для этого используют стимуляцию деятельности природной микрофлоры месторождений путем введения в скважины питательных веществ (мелассы, молочной сыворотки, микроорганизмов, продуцирующих нужные метаболиты, а также введением определенных биопродуктов, наработанных вне месторождений.

В скважину вводят несколько сот литров посевного материала, содержащего раствор мелассы. Увеличение выхода нефти составляет 16-200%. Этот эффект обусловлен влиянием следующих продуктов жизнедеятельности микроорганизмов: газов – СО₂, СН₄, N₂, Н₂ (уменьшение вязкости и увеличение давления); полисахаридов – альгината, ксантана, курдлана, декстрана, пуллулана, эмульсана (уменьшение межповерхностного натяжения между нефтью и водой); поверхностно-активных веществ – глицеридов, липидов, пептидолипидов, софролипидов и других (уменьшение натяжения); органических кислот – муравьиной, масляной, молочной и других (увеличение проницаемости пород путем растворения карбонатов и доломитов); низкомолекулярных растворителей – спиртов, кетонов (уменьшение вязкости).

Биотехнологические методы добычи полезных ископаемых экономически выгодны. Новые методы добычи позволяют разрабатывать бедные и сложные по составу месторождения, осваивать глубинные места залегания, обеспечивать комплексную утилизацию сырья, исключить загрязнение окружающей среды элементами сырья, хотя экологическое влияние массированного использования микроорганизмов изучено недостаточно.

12. Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов. Высокая эффективность биологических катализаторов и специфичность их действия делают ферменты идеальными реагентами для аналитической химии. Благодаря этим особенностям с помощью ферментов обнаруживаются вещества при предельно низкой концентрации (до 10^-12 моль/л) в присутствии множества других соединений. К настоящему времени созданы искусственные аналитические системы различных конструкций (биосенсоры, датчики, фермент­ные электроды, проточные анализаторы), потенциометрического, амперометрического, калориметрического, пьезоэлектрического и оптического типа, содержащие иммобилизованные ферменты и клетки и предназначенные для автоматического детектирования продуктов энзиматических превращений. Например, если использовать иммобилизованную глюкозооксидазу, то концентрацию окисляемой кислородом глюкозы определяют, регистрируя количество выделившегося в ходе реакции пероксида водорода полярографическим, колориметрическим или люминесцентным методом.

Технологические варианты сенсоров с иммобилизованными ферментами весьма разнообразны - колонки, трубки, полые волокна и пр. С их помощью на практике определяют концентрацию широкого спектра соединений - глюкозы, аминокислот, мочевины, пенициллина, АТФ, НАДН, ФМН, стероидов, триглице-ридов, желчных кислот и многих других. Так, американскими исследователями сконструирован микродатчик на основе глюкозооксидазы и рутениевого красите-ля, иммобилизованных в полиакриламидной матрице с использованием суб-микронных оптических волокон. Микробиосенсор, не вызывая повреждений, может быть введен в клетку и даже в отдельные ее компартменты для измерения содержания в них глюкозы и кислорода. Предложены датчики на базе иммунодетекции для проведения экспресс-анализов на присутствие производных диоксина и оценки содержания биогенных аминов (с помощью моноамино-оксидазы) в пищевых продуктах в связи с процессами их старения. Для определения мочевины ферментным электродом требуется всего 30 с.

Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов помогают выполнять десятки быстрых и точных анализов при диагностике заболеваний, контролировать содержание вредных веществ (инсектицидов, пестицидов, удобрений) в пищевых продуктах и в воздухе. Биосенсоры нашли применение в решении аналитических задач в химической и микробиологической промышлен-ности, а также в научных исследованиях.

Начаты разработки новых поколений биодатчиков на базе аффинных взаимодействий (биосродства) типа фермент-ингибитор, антитело-антиген, агонист (антагонист) - клеточный рецептор на основе полупроводниковых устройств-термисторов и пьезоэлектрического эффекта.

Термистор представляет собой полупроводниковый резистор, сопротивление которого изменяется с изменением температуры. Датчик представляет собой термистор, на поверхности которого находятся иммобилизованные клетки или молекулы ферментов или антител. Он с высокой чувствительностью регистрирует изменения температуры, происходящие при протекании биохимических реакций с анализируемыми веществами.

Особенно высокой чувствительностью обладают пьезоэлектрические биосенсоры. Принцип их действия основан на изменении частоты переменного тока, при которой пьезоэлектрик, например кристалл кварца, колеблется в резонансном режиме. Химически чистый и физически однородный кристалл пьезоэлектрика характеризуется постоянной резонансной частотой колебаний, которая для кварца составляет 9 или 14 МГц. Если на кристалл налипает то или иное вещество, частота резонансных колебаний меняется в соответствии с уравнением:

dν/ν = -dm/Apt,

где v - частота колебаний; dv - ее приращение; dm - изменение массы кристалла; А - поверхность кристалла; р - его плотность; t - его толщина.

Пьезоэлектрики регистрируют изменение массы порядка 10^-12г. Биосенсоры на их основе содержат иммобилизованный на пьезокристалле фермент, антитело, антиген или нить ДНК (РНК). О наличии детектируемого агента, вступающего в ферментативную, иммунную реакцию или образующего гибридную молекулу (ДНК (РНК) с иммобилизованным биообъектом, свидетельствует формирование соответствующего комплекса на пьезоэлектрике, которое увеличивает его массу и меняет частоту резонансных колебаний. С помощью пьезоэлектрического биосенсора с иммобилизованным антигеном можно обнаружить антитела в сыворотке крови, разведенной в 1000 раз.

Правда, в водном растворе кристалл реагирует слабее (изменением резонансной частоты) на увеличение своей суммарной массы, чем на воздухе. Поэтому предполагают погружать пьезоэлектрический биосенсор в раствор, где будет формироваться фермент-субстратный (фермент-ингибиторный) или иммунный комплекс, а далее определять колебательные характеристики кристалла в воздухе. Высокая чувствительность пьезоэлектриков к изменениям массы в воздушной среде позволяет использовать их в биосенсорах на газы, загрязняющие атмосферу.

Учеными из Университета Пердью (США) разработаны био-оптические лазерные диски “BioCD”, которые, в перспективе, предполагается применять при проведении детального анализа крови. Принцип действия “BioCD” аналогичен принципам, положенным в основу традиционных компакт-дисков. В частности, как и обычные носители, “BioCD” имеют дорожки. Правда, они используются не для записи информации, а для хранения специальных веществ, реагирующих на строго определенный тип белков. Другими словами, треки “BioCD” напоминают микроскопические пробирки с реактивами. Для проведения анализа достаточно нанести каплю крови на поверхность диска и считать результаты при помощи лазерного привода.

По словам Дэвида Нолта, руководителя проекта, человеческая кровь содержит порядка десяти тысяч различных белков, которые, в идеале, должны регистрировать био-оптические диски. Ведь даже незначительные изменения концентрации некоторых из этих белков могут предвещать развитие серьезных заболеваний. Следует отметить, что в настоящее время при проведении детальных исследований крови применяется очень дорогое оборудование стоимостью до 50 тысяч долларов и выше. Вместе с тем, появление био-оптических детекторов позволит значительно снизить стоимость проведения процедур, поскольку считывать данные можно будет посредством лишь незначительно модифицированных CD-приводов. Правда, в настоящее время предложенная методика нуждается в серьезных доработках, и прежде чем “BioCD” появятся на рынке, пройдет не менее десяти лет.

Иммобилизованные клетки микроорганизмов обычно применяют в комбинации с амперометрическими или потенциометрическими (газовыми) электродами для регистрации отдельных веществ и комплексных физиолого-биохимических параметров, которые трудно или вовсе невозможно оценить с помощью изолированных ферментов: потребление кислорода (показатель органического загрязнения природных или сточных вод), измеряемое амперометрически по поглощению О₂ или потенциометрически по образованию СО₂ клетками гриба Trichosporon cutaneum или бактерий Azotobacter vinelandii, E- coli и др.; токсичность водного раствора или воздуха, измеряемая сенсорами на базе иммобилизованных цианобактерий, у которых активность фотосистемы II снижается при наличии в среде токсических ком­понентов, особенно гербицидов; мутагенное действие тестируемого агента, определяемое стандартными методами обнаружения мутантных клеток, например, растущих и соответственно выделяющих СО₂ лишь на обогащенной среде.

Микробные биосенсоры, в отличие от ферментных, не требуют регенерации кофакторов, стабильны (срок службы от 5 до 60 дней), причем стабильность может быть повышена периодическим погружением иммобилизованных клеток в свежую питательную среду. Недостаток микробных биосенсоров - медленный отклик на детектируемый агент (обычно от 10 до 60 мин), что объясняется затратами времени на транспорт этого агента внутрь клетки и его ферментативное расщепление, предшествующее появлению вне клеток продуктов, взаимодействующих с электродом (О₂, СО₂ и др.). Клетка в некоторых случаях откликается и на посторонние агенты, поэтому иммобилизованные на биосенсоре клетки целесообразно обрабатывать ингибиторами побочных ферментативных реакций, не специфичных по отношению к детектируемому агенту.

Известны биосенсоры с соиммобилизованными клетками и изолированными ферментами, что позволяет осуществлять многостадийные ферментативные реакции. Так, соиммобилизация уреазы и нитрифицирующих бактерий на О₂ -электроде дает чувствительный биосенсор на мочевину. Возможно также совместное применение двух и более видов микроорганизмов в составе одного биосенсора.

Использование тканей растений и животных перспективно, но применяются сравнительно редко. Во многих случаях они более стабильны, чем ферменты и клетки, а порой более специфичны, чем микробные клетки. Так, глутаматный биосенсор на основе ткани свиной почки не откликается на мочевину, аланин, аргинин, гистидин и другие аминокислоты. Сложные органические соединения, такие как АМФ, дофамин, аскорбиновая кислота, в растительных тканях разлагаются до простых ионных или газообразных продуктов, что дает возможность регистрировать их ионоселективными (газовыми) электродами. Иммобилизация тканевых срезов - укрытие под сеткой или под мембраной - подкупает своей простотой. Например, дофамин регистрируют с помощью

«бананотрода» - тонкого среза мякоти банана, иммобилизованного на О₂ -электроде.

Созданы датчики, в которых используют рецепторные системы различных организмов: пучок нервов или отдельные нервы из усов краба (биосенсор на аминокислоты и пуриновые основания), щупальца синих крабов, раков (биосенсоры на аминокислоты и гормоны), собачий нос (обнаружение контрабандных наркотиков и взрывчатки). Иногда предпочитают не весь рецепторный орган, а лишь клетки или даже их органеллы, непосредственно отвечающие за узнавание того или иного агента. Таковы биосенсоры с изолированными рецепторами растений на ауксины и токсины.

Рецепторные биосенсоры дают быстрые ответы на детектируемый агент, высокоспецифичны, баснословно чувствительны: биосенсор на базе щупалец атлантического синего краба отвечает на 10^-13 моль/л глутамина. Однако изолированные рецепторы недостаточно стабильны. Продление их жизни ищут на путях инкапсулирования рецепторов в бислойные липидные мембраны, в том числе в липосомы.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: