Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР является наиболее чувствительным методом

ПЦР является наиболее чувствительным методом. Реакция обнаруживает вирусные НК. Реакция открыта в 1985 году в США.

Сутью метода является амплификация, т.е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекул ДНК in vitro. ПЦР основана на амплификации ДНК при помощи ДНК-полимеразы, которая осуществляет синтез взаимокомплементарных цепей ДНК начиная с 2-х праймеров (затравок)

Primer – фрагмент ДНК из 20-30 нуклеотидов. Синтезированный искусственно. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК. Обычно при ПЦР ставят от 25 до 40 циклов в зависимости от возбудителя. Каждый цикл состоит из трех этапов.

1. Денатурация. 92-95 градусов С, 20-60 секунд. Происходит разрыв водородных связей цепей ДНК.

2. Отжиг – присоединение праймеров. 50-60 градусов С, 40-60 секунд. Происходит забрасывание праймеров, нуклеотидов и ДНК-полимеразы.

3. Элонгация – достраивание цепей ДНК. 68-72 градуса С, 40-60 секунд. Число цепочек ДНК удваивается. Образовавшиеся в первом цикле цепочки ДНК служат матрицами для последующих циклов и т.д. Таким образом в каждом цикле идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать 2²⁵-2⁴⁰ участков ДНК, что позволяет обнаружить их методом электрофореза.

В ПЦР используют праймеры из консервативных участков ДНК вируса, которые имеют уникальную последовательность для каждого возбудителя.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: