Хімічні властивості білків

Мета роботи: ознайомитися із будовою, хімічними властивостями та функціями білків в організмі людини. На прикладі реакцій осадження білків вивчити їхні фізико-хімічні властивості.

Питання для самопідготовки:

1. Будова амінокислот.

2. Замінні і незамінні амінокислоти.

3. Пептидний зв'язок.

4. Рівні організації білкової молекули.

5. Зворотна і незворотна денатурація білка.

ТЕОРЕТИЧНА ЧАСТИНА

Одна з важливіших властивостей амінокислот — це їх здатність вступати у реакцію поліконденсації з виділенням молекули води та утворенням ковалентного пептидного зв'язку, в якому беруть участь тільки функціональні групи сусідніх амінокислот. Наприклад:

До дипептиду аналогічним чином можуть приєднуватися інші амінокислоти з утворенням три-, тетра-, пента- і т.д. аж до крупного поліпептиду— білка. Найменування пептидів складається з першої α-N-кінцевої амінокислоти з закінченням «-іл», наступних амінокислот з таким же закінченням і повної назви С-кінцевої амінокислоти із вільною α-СООН-групою.

Білки – високомолекулярні азотовмісні органічні сполуки, побудовані з великої кількості залишків амінокислот, сполучених між собою пептидними (кислотно-амідними) зв'язками в поліпептидний ланцюг (ланцюги), що мають складну структурну просторову організацію і виконують найважливіші функції живих організмів. В їх склад входить вуглець, водень, кисень, сірка. В багатьох зустрічається – фосфор, йод, залізо, мідь, магній та ін.

Білкам належить першорядна роль у структурі і функціях живих організмів. Тканини людини та тварин вміщують 10-20 % білків. Життя – це засіб існування білкових тіл. Основна властивість живої матерії – обмін речовин – це властивість живих білків. Вони виконують такі функції:

1. Структуроутворююча – структурні білки відповідають за підтримання форми та стабільності клітин та тканин. До цих білків відносяться колаген, гістони.

2. Транспортна. Наприклад, гемоглобін еритроцитів переносить кисень і диоксид вуглецю між легенями та тканинами, а преальбумін (білок плазми крові) переносить гормони щитоподібної залози.

3. Захисна. Імунна система захищає організм від збудників хвороб. В якості ключового компоненту цієї системи виступає імуноглобулін, а також білки системи комплементу.

4. Регуляторна. Деякі білки являються гормонами. Це інсулін, соматотропін.

5. Ферментативна. Білки є біологічні каталізатори, та здійснюють в організмі реакції обміну речовин.

6. Рухова. Білки актин та міозин беруть участь у процесах скорочення та розслаблення м'язів.

7. Запасна. В рослинах містяться запасні білки, які є цінними поживними речовинами. В організмі тварин м'язові білки служать резервними поживними речовинами, які мобілізуються при крайній необхідності.

Відрізняють чотири рівні організації білкової молекули – первинна, вторинна, третинна і четвертинна структури білка.

Первинна структура — це кількість, якість та порядок розміщення залишків амінокислот у поліпептидному ланцюгу, розташованому на площині.

Вторинна структура — це форма та ступінь спіралізації, утворення слоїсто-складчастих структур у поліпептидному ланцюгу у просторі. У виникненні спіральних ділянок білка беруть участь водневі та дисульфідні зв'язки. Є α- та γ-спіралі, які відрізняються одна від одної кількістю амінокислотних залишків у одному витку, а також β-складчаста структура.

Третинна структура — це об'ємна тримірна конформація поліпептидного ланцюгу, яка утворюється за рахунок її вигинів та накладень. Основними хімічними зв'язками, які виникають при формуванні третинної структури, є: слабкі вандерваальсові зв'язки, ефірні, іонні, дисульфідні та водневі зв’язки.

Четвертинна структура білку виникає в наслідок з'єднання декілька білкових часток (субодиниць), які мають первинну, вторинну та третинну структури, в макромолекулу, єдину в структурному та в функціональному відношеннях.

Розмір і форма білкових молекул, їх амфотерність, наявність електричного заряду, розчинність та інші фізико-хімічні властивості у більшому ступені визначають біологічні функції білків та їх участь в процесах обміну речовин.

Дякуючи наявності в білках амінних і карбоксильних груп, вони в кислому середовищі дисоціюють як основи, а в лужному — як кислоти, отже є амфотерними електролітами, що обумовлює їх значення як буферних систем, які підтримують постійність реакції середовища в тканинах організму. Якщо реакція середовища пригнічує дисоціацію білку, електричний заряд становиться найменшим (теоретично дорівнює нулю), білок знаходиться в ізоелектричному стані. Значення рН середовища, при якому білок знаходиться в ізоелектричному стані, називається ізоелектричною крапкою.

Білок — амфотерний поліелектроліт — у водних розчинах має властивості слабких кислот або слабких основ в залежності від переваги в молекулі білка залишків моноамінодикарбонових (глутамінової та аспарагінової) кислот або залишків диаміномонокарбонових кислот. Білки кислого характеру (альбуміни, глобуліни) у водному розчині несуть негативний заряд; білки основного характеру (протаміни, гістони) — позитивний заряд. Наявність заряду на макромолекулі білка стабілізує його в розчині, тому що мішає злипанню білкових часток та випаданню їх в осад. Змінюючи концентрацію іонів в середовищі (додаванням кислоти або луги), можна зменшити дисоціацію білкових часток та досягти ізоелектричного стану білка. Концентрація іонів водню, при якій білок знаходиться в ізоелектричному стані, як було сказано вище є ізоелектрична крапка білку (ІЕК) і виявляється водневим показником (рН). ІЕК характеризує хімічну природу білка. Для кожного білка існує своя ІЕК. При рН, близькому до ІЕК, розчинність, набухання, в'язкість білка становляться мінімальними, та навпаки, утворення осаду, аглютинація чи комплексоутворення — максимальними. Таким чином, в ІЕК білок нестійкий і легко випадає в осад, особливо в присутні водовіднімаючих речовин (спирт, ацетон та ін.).

У водному розчині більшість білків та їх часток (міцел) заряджені та гідратовані. При додаванні у великих концентраціях солей лужних та лужно-земельних металів (сульфату натрію, сульфату магнію, хлориду натрію та ін.), а також нейтральних солей, наприклад, сульфату амонію, молекули яких у водних розчинах гідратовані, виникає зруйнування оболонок (дегідратація білка). В результаті цього знижується електричний заряд білкової молекули в наслідок адсорбування на ній іонів солей, частки білку злипаються одна з одною, збільшуються і випадають в осад. Таке осадження білку в розчинах отримало назву «висалювання» або зворотнє осадження. При висалюванні білок за звичаєм не загублює притаманні йому фізико-хімічні та біологічні властивості. Він знову розчиняється у воді і проявляє майже з тією же активністю ферментативні, антигенні, імунні та інші біологічні властивості, тобто залишається нативним (натуральним).

Білки відрізняються один від одного зарядом та гідрофільністю, тому можна розділити білки, використовуючи для їхнього осадження різні концентрації солей або органічних розчинників у середовищі.

Білки під впливом фізичних (температура, ультразвук, іонізуюча радіація та інше), хімічних (мінеральні та органічні кислоти, луги, органічні розчинники, важкі метали, алкалоїдні реактиви та інше) і біологічних (наприклад, при дії протеолітичних ферментів) факторів отримують глибокі зміни, пов'язані з порушенням четвертинної, третинної та навіть вторинної структури, що призводить до змін фізико-хімічних і біологічних властивостей білка, а саме до денатурації. При денатурації білка відмічається розрив вторинних зв'язків (водневих, дисульфідних, електростатичних, ефірних, вандерваальсових та ін.). Це призводить до зміни просторової структури та зменшенню її гідрофільних властивостей. Білок стає більш гідрофобним, загублює здатність розчинятися в звичайних для нього розчинниках і свої біологічні функції (ферментів, гормонів і ін.). Такий вид денатурації вважається незворотнім у відміну від зворотного.

Білки бувають прості та складні. Прості білки складаються тільки з а-амінокислот, а складні мають ще неамінокислотні компоненти: гем, похідні вітамінів, ліпідні, вуглеводні чи фосфатні компоненти.

До простих відносяться альбуміни, глобуліни, проламіни, пістони.

У складних білків (попередня назва — протеїди) два компоненти - простий білок та небілкова речовина - сполучені між собою ковалентними або слабкими (іонними, водневими, вандерваальсовими та ін.) зв'язками. Небілкова частина складних білків називається простетичною групою. До складних білків відносяться нуклеопротеїни, хромопротеїни, фосфопротеїни, глікопротеїни, металопротеїни та ін.

ПРАКТИЧНА ЧАСТИНА

Практичне значення роботи: осадження білка методом висалювання використовують для розділу білкових фракцій при одержанні очищених білкових (наприклад, гормональних) препаратів, для розділу альбумінів і глобулінів і визначення їх співвідношення в сироватці крові. Процес денатурації білків використовується для осадження білків в біологічному матеріалі з подальшим визначенням у ньому небілкових і низькомолекулярних речовин; для виявлення присутності білку і його кількісного визначення. Знаючи ізоелектричну крапку індивідуальних білків, можна підібрати максимальні умови для осадження їх із біологічних рідин, що містять суміш різних білків.

Матеріали і реактиви: нерозведений яєчний білок, 1%-вий розчин яєчного білку, 10%-вий сульфат амонію, 10%-вий розчин ацетату свинцю, 10%-вий розчин сульфату міді, 10%-ві розчини азотної і соляної кислот, дистильована вода; пробірки, піпетки, штатив для пробірок, пальник, розчин желатину (1%-вий); 0,1 і 1 моль/л розчини оцтової кислоти, 0,1 моль/л розчину ацетату натрію, 96%-вий етиловий спирт (або 95%-вий ацетон), скляні палички, піпетки.

Принцип методу:

1.Зворотне осадження білків – висалювання. Висалювання – зворотна реакція осадження білків із розчинів за допомогою великих концентрацій солей лужних і лужноземельних металів: Na₂SО₄, NaCl, MgSО₄. а також (NH₄)₂SО₄. При їхньому додаванні до розчину білка відбувається дегідратація білкових часток, і білки випадають в осад. При додаванні води до цього розчину гідратаційна оболонка білкових часток відновлюється, і осад розчиняється.

2. Незворотне осадження білків. Денатурація білка (незворотне осадження) – це порушення структури білка і втрата ним біологічних властивостей. Осаджуються білки солями важких металів, мінеральними й органічними кислотами, кип'ятінням. При незворотному осадженні порушується гідратаційна оболонка і заряд білка. При подальшому додаванні води осаджений білок не переходить у розчин.

3. Визначення ізоелектричної крапки білка. Визначення ізоелектричної крапки білків засновано на спроможності білків під дією осаджувачів, що викликають дегідратацію білків, при значенні рН середовища, що відповідає їх ізоелектричній крапці, легко осаджуватися.

Хід роботи:

1. Зворотне осадження білків – висалювання. У пробірку наливають 1 мл нерозведеного яєчного білка, додають такий же об'єм розчину (NH₄)2SО₄. Рідину збовтують і спостерігають невеличке помутніння. Доливають 1 мл води – помутніння зникає.

2. Незворотне осадження білків:

а) осадження білків солями важких металів. У пробірки наливають по 1 мл 1%-вого розчину білка, в одну додають декілька крапель розчину (СН₃СОО)₂Рb, у другу – розчину CuSО₄;

б) осадження білків мінеральними кислотами. У дві пробірки наливають по 1 мл кислот: у першу – азотну, у другу – соляну. Потім у кожну обережно по стінці доливають рівний об'єм розчину білка;

в) осадження білків при нагріванні. У пробірку наливають 1 мл розчину білка і кип'ятять.

Незворотність осадження в пунктах досліду 2 установлюють додаванням 0,5-1,0 мл води.

Результати дослідів заносять у таблицю:

Таблиця 4

Результати якісних реакцій на осадження білків

3. Визначення ізоелектричної крапки білка. У 6 пробірок поміщають відповідну кількість (мл) розчинів оцтової кислоти, ацетату натрію, дистильованої води і желатину (таблиця). Вміст кожної пробірки перемішують. Потім у всі пробірки повільно по стінці доливають по 2 мл спирту (або ацетону). Через 30 хв визначають ізоелектричну крапку. Вона буде відповідати рН пробірки з максимальним ступенем помутніння. Результати досліду заносяться у таблицю:

Таблиця 5

Схема і результати досліду на визначення ізоелектричної крапки білка

Примітка: (-) - відсутність помутніння; (+) - поява помутніння; (++) - середнє помутніння; (+++) - значне помутніння.

Зробити висновки.

Контрольні питання:

1. Визначення поняття білків. Їх функції.

2. В яких умовах відбувається гідроліз білків до амінокислот?

3. Які якісні реакції на білки Ви знаєте?

4. Перерахуйте основні властивості білків.

5. Назвіть структури білка. Які типи зв'язків для них характерні?

6. Що таке денатурація білка? Які зміни відбуваються при цьому в білковій молекулі?

7. Дати визначення поняттю "ізоелектрична крапка білка".

8. Класифікація білків.

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ № 6

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: