Определение изоэлектрической точки белков

Белки по химическим свойствам являются амфотерными веществами, т.к. в их молекуле имеются свободные карбоксильные и аминные группы. Кислотные свойства белков обусловливаются за счет концевых карбоксильных групп и дикарбоновых аминокислот. Кислую среду помогают создавать фенольные гидроксилы в составе тирозина и сульфгидрильные группы серусодержащих аминокислот.

Щелочными свойствами белки обязаны аминным, иминным и гуанидиновым группам диаминомонокарбоновых кислот.

Присутствие одновременно кислых и основных групп в белках в водной среде обусловливают образование двойных ионов:

NH₂ NH₂ NH₃ ⁺

/ / /

R-СН → R- СН + H⁺ → R-СН

\ COOH ← \ COO^- ← \ COO^-

В щелочной среде белки играют роль аниона. При потере протона из группы – NH₃ +, например при действии гидроксида натрия, образуется натриевая соль белка (протеинат натрия):

NH₃ ⁺ NH₂

R /СН + NaOH → R /СН + Na⁺ + H₂O^-

\ COO^- \ COO^-

В кислой среде белок играет роль катиона: например с соляной кислотой получается хлористоводородная соль (протеинхлорид):

NH₃ ⁺ NH₃ ⁺

R /СН + HCL→ R /СН + CL^-

\ COO^- \ COOH

Следовательно, концентрация водородных ионов – определяющий фактор поведения белка в растворе. В кислой среде уменьшается диссоциация карбоксильных групп белка и он переходит в катион; в щелочной среде подавляется диссоциация основных групп и белок переходит в анион.

При определенном значении pH (для каждого белка неодинаковое) диссоциация карбоксильных групп становится равной основной: число положительных зарядов белковой молекулы сравнивается с числом отрицательных и в целом заряд белковой частицы становится равным нулю.

Белок, лишенный электрического заряда, находится в изоэлектрическом состоянии и в электрическом поле не будет передвигаться ни к катоду, ни к аноду, а pH раствора, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой белка или изопунктом белка. Растворы белков в изоэлектрическом пункте проявляют наименьшую устойчивость, в качестве стабилизирующего фактора остается только гидратационная оболочка. У большинства белков изоэлектрическая точка (ИЭТ) близка к нейтральной реакции среды, но несколько сдвинута в кислую сторону, что объясняется преобладанием кисляях свойств над щелочными, и в нейтральном растворе они ведут себя как слабые кислоты.

Небольшое число белков организма (гистоны, протамины) содержат больше аминных групп, они богаче диаминокислотами. В нейтральной среде они ведут себя как слабые основания и их изоэлектрическая точка лежит в слабощелочной среде.

Приборы. Штатив с пробирками. Пипетка на 2 мл с делениями. Пипетка на 10 мл с делениями.

Реактивы. Уксуснокислый натрий, 0,1 н. раствор. Уксусная кислота, 0,1 н. раствор. Желатин, 1%-ный раствор. Этиловый спирт, 96%-ный раствор.

Ход работы. Готовят серию буферных растворов.

Содержимое пробирок взбалтывают.

В пробирку 4 прибавляют из пипетки медленно и при помешивании столько спирта, чтобы спустя некоторое время оставалась едва заметная муть. Для этой цели расходуется, как правило, 2-3 мл спирта.

Во все остальные пробирки добавляют, помешивая, столько же спирта, сколько добавлялось в пробирку 4.

Через 20-30 мин наблюдают помутнение, которое обозначают по нижеприведенной схеме (+ - слабая коагуляция; + + - средняя коагуляция; + + + - сильная коагуляция):

Следовательно, ИЭТ желатина соответствует pH 4,7. В зависимости от сорта желатина ИЭТ может колебаться в небольших пределах.

Задание: сделать вывод по результатам опыта, устно дать определение ИЭТ, рассказать о значении данного свойства.

Занятие 8 – Методы анализа аминокислот и белков

Цель занятия: изучить принципы хроматографических методов

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: