Определение глюкозы в крови глюкозооксидазным методом. 1. Для определения глюкозы в крови глюкозооксидазным методом готовят опытную и холостую пробы в соответствии с приведенной ниже таблицей: Отмерить (мл)

1. Для определения глюкозы в крови глюкозооксидазным методом готовят опытную и холостую пробы в соответствии с приведенной ниже таблицей:

2. Полученные смеси встряхивают и центрифугируют при 8000g в течение 5 мин.

3. Далее с пробами работают в соответствии со следующей таблицей: из холостой и опытной пробирки отбирают по 0,2 мл надосадочной жидкости и смешивают с 2,0 мл рабочего реагента, который содержит глюкозооксидазу.

4. Затем опытную пробу инкубируют в течение 15 мин. при 37°С.

5. Оптическую плотность в опытной пробе измеряют при 520 нм против холостой пробы.

6. Концентрацию глюкозы (в ммоль/л) в сыворотке крови определяют с помощью калибровочного графика.

Для построения калибровочного графика в две пробирки вместо 0,05 мл сыворотки крови вносят по 0,05 мл стандартных растворов глюкозы с концентрациями 5,55 ммоль/л и 16,67 ммоль/л, соответственно.

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретические данные по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы работы.

3. Описать результаты.

4. Сделать выводы.

Лабораторная работа № 9

Оборудование и материалы:

Реактивы:

· мышечная ткань крысы;

· NaCl, 0,9% раствор;

· никотинамид;

· фосфатно-солевая буферная смесь (ФСБС):
1% раствор Na₂HPO₄, 0,44% раствор NaCl, 0,03% раствор KCl, 0,02% раствор MgSO₄×7H₂O;

· глюкоза, 0,02 М раствор в ФСБС;

· АТР, 0,06 М, 0,6 М растворы в ФСБС;

· АМР, 0,6 М раствор в ФСБС;

· цитрат Na, 0,3М раствор в ФСБС;

· цитрат Na /АМР, 0,6 М/0,3 М раствор в ФСБС;

· сульфат цинка 7-водный (ZnSO₄×7H₂O), 5% раствор;

· гидроксид натрия (NaOH), 0,3 М раствор;

· серная кислота (H₂SO₄), конц.;

· смесь*: сульфат меди (II) (CuSO₄), ортофосфорная кислота (H₃PO₄);

· П -оксидифенил, 1,5% раствор в диметилформамиде (HCON[CH₃]₂);

· молочная кислота, стандартный раствор, 2,5 ммоль/л;

· трихлоруксусная кислота (ТХУ), 5% раствор;

· рабочий реагент для глюкозооксидазного метода (смесь ферментов: глюкозооксидазы и пероксидазы);

· глюкоза, стандартные растворы 5,55 ммоль/л и 16,67 ммоль/л;

· вода дистиллированная.

Теоретическая часть

Углеводный обмен

В клетках высших растений и млекопитающих глюкоза превращается в пировиноградную кислоту (пируват) по метаболическому пути, который называется гликолизом. Гликолиз может протекать как в отсутствие кислорода (анаэробно), так и в его присутствии (аэробно). В анаэробных условиях конечным продуктом гликолиза является молочная кислота. В аэробных условиях (в присутствии кислорода) происходит превращение пировиноградной кислоты в ацетил-СоА, который, далее может вступать в цикл лимонной кислоты. В этом случае молекулы глюкозы полностью окисляются до CO₂ и H₂O. При этом большая часть потенциальной свободной энергии, заключенной в молекулах глюкозы, запасается в форме АТР в результате реакций окислительного фосфорилирования. Несмотря на то, что глюкоза служит главным видом метаболического топлива для многих тканей, этот моносахарид (а также его метаболиты) участвует и в других внутриклеточных процессах:

1) в частности глюкоза способна резервироваться в виде полимера гликогена, который запасается в ряде тканей, в особенности в скелетных мышцах и в печени;

2) субстратом пентозофосфатного пути также является глюкоза, а точнее глюкозо-6-фосфат, который служит одним из промежуточных продуктов гликолиза. Пентозофосфатный путь является источником восстановительных эквивалентов (NADPH), используемых в процессах восстановительного биосинтеза, например, в биосинтезе жирных кислот; кроме того, он является источником рибозы, необходимой для синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот;

3) дигидроксиацетонфосфат, образующийся в одной из реакций гликолиза, является источником глицерола, используемого в синтезе триацилглицеролов (жиров);

4) наконец, пируват и ряд промежуточных соединений цикла лимонной кислоты выступают в роли источников углеродных скелетов, используемых в синтезе аминокислот, а ацетил-СоА служит основным интермедиатом в синтезе длинноцепочечных жирных кислот и холестерола – предшественника всех синтезируемых в организме стероидов.

Гликолиз

Гликолиз является главным путем утилизации глюкозы и протекает во всех типах клеток от прокариот до эукартот. Уникальность данного метаболического пути состоит в том, что он может происходить независимо от присутствия или отсутствия кислорода.

В основе данного основополагающего процесса утилизации глюкозы лежат 10 реакций, из которых первых пять объединяют под общим названием подготовительной стадии гликолиза (1-ая стадия), а пять 5 последующих реакций рассматривают как стадию запасания энергии (2-ая стадия).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: