ТОР 5 статей: Методические подходы к анализу финансового состояния предприятия Проблема периодизации русской литературы ХХ века. Краткая характеристика второй половины ХХ века Характеристика шлифовальных кругов и ее маркировка Служебные части речи. Предлог. Союз. Частицы КАТЕГОРИИ:
|
КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИЦель: 1. Ознакомиться с основными, наиболее часто употребляемыми питательными средами, методами их приготовления и культивирования микроорганизмов 2. Выполнить I этап выделения чистой культуры аэробов
Материалы и оборудование: бактериологическая петля, предметные и покровные стекла, пробирки, ватные пробки, чашки Петри, шпатели, питательные среды, спиртовка или газовая горелка.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ Известно значительное количество питательных сред, используемых для культивирования и поддержания (сохранения) микроорганизмов. Питательные среды – это среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Еще в 1930 году их было классифицированы не менее двух тысяч наименований, но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико, а их композиции создаются на определенных общих принципах. Для размножения любых бактерий необходимо обеспечить подходящее биофизическое окружение и биохимические питательные компоненты. Любая питательная среда должна соответствовать следующим требованиям: · содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; · иметь оптимальную влажность, · вязкость, · рН, · быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной. Питательные среды должны иметь определенную реакцию, являющуюся оптимальной для изучаемого микроба. В большинстве случаев бактерии хорошо растут в слабощелочной (pH=7,2-7,4), а грибы – в слабокислой (pH=6,8-4,5) среде. Для роста автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно просты: вода, двуокись углерода и соответствующие неорганические соли. Например, бактерии рода Nitrobacter ассимилируют СО2 и получают энергию путем окисления нитритов в нитраты. Гетеротрофные бактерии получают энергию в результате окисления (диссимиляции) восстановленных углеродных соединений. Гетеротрофные бактерии используют органические соединения в двух целях: 1) в качестве источника энергии; при этом органическое вещество окисляется или расщепляется с высвобождением энергии и образованием ряда конечных продуктов типа СО2, органических кислот и др; 2) в качестве субстратов, ассимилируемых непосредственно с образованием клеточных компонентов или для их синтеза в реакциях, требующих затрат энергии. Так, E.coli способна к росту на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Молочнокислые же бактерии растут на сложных средах, содержащих в качестве добавок ряд органических соединений (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать самостоятельно. Такие соединения называются факторами роста. Организмы, которые нуждаются в их добавлении к ростовой среде, называются ауксотрофными по соответствующим соединениям. Другая группа организмов, способная к росту на простых средах, содержащих источник углерода и энергии, а также набор основных биогенных элементов, получила название прототрофных. Выбор питательной среды зависит в значительной степени от целей эксперимента, а существующая классификация питательных сред учитывает характеристику их следующих особенностей. По составу питательные среды делятся на натуральные и синтетические. Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов растительного или животного происхождения, имеющих неопределенный химический состав. Примерами питательных сред такого типа являются среды, представляющие собой смесь продуктов распада белков (казеина, мышц млекопитающих), образующихся при их гидролизе. Кислотный (НС1) гидролиз белков используется для приготовления полных гидролизатов. Действие ферментов типа трипсина, панкреатина, папаина приводит лишь к частичному (неполному) гидролизу белков, в результате чего образуются пептоны. Как правило, на пептонных питательных средах микроорганизмы растут лучше, чем на питательных средах, приготовленных из полных гидролизатов или смесей аминокислот. При ферментативном гидролизе, вероятно, сохраняются лабильные факторы роста. Кроме того, многие микроорганизмы лучше размножаются на средах, содержащих небольшие пептиды, потому что их они могут усваивать непосредственно, а отсутствующие аминокислоты - нет. Обычно в составе такой среды ферментативный гидролизат белка обеспечивает потребность в таких источниках азота, как аминокислоты, углеводы (глюкоза), используется как источник углерода и энергии, соли удовлетворяют потребности бактерий в неорганических ионах, а дрожжевой экстракт обеспечивает потребности в витаминах. К питательным средам неопределенного состава можно отнести и среды, полученные на основе растительного сырья: картофельный агар, томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои сена и соломы и др. Основное назначение таких питательных сред - выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур микроорганизмов. К числу сред неопределенного состава относят и среды полусинтетические. В такую среду вносят известные соединения как явно необходимые; а также добавляют небольшое количество дрожжевого или кукурузного экстракта (или любого другого природного продукта) для обеспечения неизвестных потребностей роста. Такие среды часто используются в случае промышленного культивирования биологических объектов для получения продуктов метаболизма. Синтетические среды - это среды определенного состава, представленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точно указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов. Обязательными компонентами таких сред являются неорганические соединения (соли) и углерод - и азотсодержащие вещества (типичными представителями являются глюкоза и (NH4)2SO4. Часто к таким средам добавляют буферные растворы и хелатирующие соединения. Ауксотрофные организмы растут на таких средах только при добавлении соответствующих факторов роста. Основное назначение таких питательных сред - изучение особенностей физиологии и метаболизма микроорганизмов, выделение генетических рекомбинантов и т. д. По назначению среды разделяют на элективные и дифференциально-диагностические. Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов (например, среда Китт-Тароцци – для анаэробной микрофлоры, среда Петраньяни – для кислотоустойчивых микробов (возбудитель туберкулеза)). Элективными могут являться естественные среды накопления сенной и картофельной палочек. Например, для преимущественного выделения грамотрицательных бактерий бывает достаточным добавления в питательную среду трифенилметановых красителей (кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый и т. д.). Для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этой концентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий, т. е. при получении накопительной культуры. Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности (т.е. для выращивания определенного вида микробов), в клинической бактериологии и др. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. Т.е. критерием для дифференциации служит способность различных видов микробов ферментировать те или другие углеводы и многоатомные спирты, содержащиеся в питательных средах. К таким средам относятся среды Гиса с индикатором, агар Эндо и др. В состав дифференциально-диагностической среды входят: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма; в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Например, среда Эндо позволяет отличить клоны, сбраживающие лактозу, от клонов, не обладающих этим свойством. Основными компонентами этой среды являются питательный (пептонный) агар, углевод и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом (реактив Шиффа). Исходная питательная среда окрашена в розовый цвет. Микроорганизмы, не сбраживающие лактозу, образуют бесцветные колонии. При сбраживании лактозы до ацетальдегида последний реагирует с сульфитом и развивается красная окраска соответствующих колоний. Среда с эозином и метиленовым синим (среда Левина) в качестве индикаторов содержит эозин и метиленовый синий и исходно окрашена в черно-синий цвет. Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии, окрашенные в черный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие этим свойством, бесцветны. Подобные изменения окраски происходят потому, что красители присутствуют в среде не в виде самостоятельных соединений, а в виде комплексов с веществами питательной среды. При низких значениях рН эти комплексы выпадают в осадок, исходные же красители в этих условиях растворимы, при больших рН комплексы красителей бесцветны, тогда как метиленовый синий приобретает синюю окраску. Данная среда позволяет дифференцировать бактерии рода Escherichia от бактерий рода Proteus. Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:
|