Методика постановки. Из исследуемого материала выделяют НК, которую помещают в чистую пробирку и добавляют амплифицирующую смесь

Из исследуемого материала выделяют НК, которую помещают в чистую пробирку и добавляют амплифицирующую смесь, которая состоит из:

- Буфера

- ДНК-полимеразы

- Раствора 2-х видов праимеров

- 4-х видов нуклеотидов

- Магний-хлорного катализатора

- Крезолового красного для визуальной оценки

- Доливают деионизированной воды.

- Сверху капают минеральное масло.

Пробирки помещают в програмируемый термостат-амплификатор и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе для соответствующего вида возбудителя (2-3 часа). Одновременно ставят положительный и отрицательный контроль.

Регистрация результатов – детекция амплификонов. Проводят методом электрофореза в 1-2% агаровом геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и высвечивается в виде полосок при УФО (трансилюминатор).

Патогенез

Различают три вида воздействий, оказываемых вирусами животных на клетки. Легче всего выявляется деструктивный, или цитолитический, эффект, для которого характерно обширное повреждение множества различных клеточных органелл. Вероятно, вирус - специфические макромолекулы вызывают первичное повреждение, влекущее за собой цепь вторичных деструктивных процессов, в которых участвуют уже продукты метаболизма самой клетки. На другом конце спектра возможных последствий находится явление трансформации, когда зараженная вирусом клетка приобретает способность к неограниченному делению. По-видимому, это результат устойчивой интеграции вирусного генома или его части с геномом клетки, которая не приводит к ее гибели. Трансформированная клетка часто выходит из-под контроля механизмов, регулирующих клеточное деление. Действие некоторых вирусов, геном которых не включается в хромосомы клеток, занимает промежуточное положение между резко выраженным деструктивным эффектом и трансформирующим действием. В этих случаях зараженные клетки еще некоторое время функционируют и по меньшей мере в одном случае - при заражении парамиксовирусами - продолжают расти и делиться, одновременно продуцируя вирус («персистентная инфекция»). Возможна еще одна категория реакции клеток, при которой можно говорить об индуктивном действии вируса. Многие вирусы способны индуцировать образование в зараженной клетке белков, кодируемых не вирусным, а клеточным геномом, но, по-видимому, синтезируемых клетками в ответ на вирусную инфекцию. Этот тип реакции не обязательно связан с тем или иным конечным результатом взаимодействия вируса с клеткой. Зная, что многие вирусы вызывают резкие деструктивные изменения клеток-хозяев, биохимики заинтересовались вопросом, прекращается ли при этом синтез всех клеточных белков РНК и ДНК, и если да, то в какой последовательности. Ответы сводятся к следующему: 1. Вероятно, различные вирусы подавляют синтез клеточных белков, используя разные механизмы. Степень и время этого подавления тоже неодинаковы. 2. Нередко вирус блокирует накопление клеточной РНК, приостанавливая процессинг пре-р РНК, но никак не влияя на ее синтез. Образование клеточной т РНК часто не снижается. Во многих случаях бывает нарушен синтез клеточных м РНК, но механизм этого нарушения совершенно неясен. 3. Нередко бывает подавлена инициация синтеза клеточной ДНК, однако при некоторых вирусных инфекциях клетки, уже вошедшие в фазу S, могут завершить цикл синтеза ДНК, а клетки, прошедшие через фазу S, могут пройти и через митоз. Ингибирование синтеза клеточной ДНК- это вероятно, вторичное следствие прекращение синтеза белка, так как синтез ДНК идет лишь в том случае, если одновременно продолжается синтез белка.

Пути проникновения: носоглотку (оспа), пищеварительный тракт (ящур), кожного контакта (оспа), при + насекомых (арбовирусы) далее размножается на месте проникновения или в опр. тк. далее разносится с кровью или по нервн. путям. Выделение из организма: с фекалиями, мочой, носовым экссудатом (пантропные инф. вирусы). Ч/з носоглотку (грипп, ринотрахеит). Со слюной (бешенство), из кожн. поражений (оспа), со спермой (лейкоз, ящур). 5)факторов влияющих на чуств. к вирусам: 1)гормоны 2)возраст 3)беременность 4)ионизирующее излучении 5)температура

Экспресс-методы

1)Обнаружение вирусных АГ. Используют серологические реакции. 1.РИФ – реакция иммунофлюорисценции. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом. 2.ИФА – иммуно-ферментный анализ. АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию. 3.РСК – реакция связывания комплемента. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная. 4.РДП - реакция диффузной преципитиции. Метод обнаружения – образование контура преципитации. 5.РНГА – реакция непрямой гемаглютинации. агглютинация эритроцитов. 6.РТГА – реакция торможения гамаглютинации 7.РТГАд – реакция торможения гемадсорбции 8.РН – реакция нейтрализации. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса. 2)Обнаружение телец-включений. Представляют собой скопления зрелых вирионов в кл., где шла их репродукция, или массы кл. материала, измененного под влиянием репродукции вируса. 3)Обнаружение виронов. С + эл. микросокопа, только оспа – световой. 4)Биопроба – экспериментальное заражение материалом от больных жив. лаб. или естественно восприимчивых жив.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: