Как ставится ориентировочная реакция агглютинации на стекле?

На чистое предметное стекло пастеровской пипеткой наносят каплю агглютинирующей противовибрионной сыворотки в разведении 1:25 и рядом (другой пипеткой) каплю физиологического раствора (контроль антигена). В ту и другую каплю пастеровской пипеткой добавляют по 1-2 капли взвеси вибриона. Осторожно перемешивают петлей антиген вначале с физиологическим раствором, а затем с иммунной сывороткой (но не наоборот!). Чтобы ускорить наступление реакции агглютинации, предметное стекло, на котором производится опыт, рекомендуется слегка покачивать и очень осторожно подогревать высоко над пламенем спиртовки. Наблюдают за агглютинацией невооруженным глазом или пользуясь лупой. Реакция агглютинации более отчетливо видна, если смотреть на каплю снизу вверх. Феномен агглютинации проявляется образованием взвешенных хлопьев и просветлением жидкости в капле с сывороткой. В контроль ной капле (физиологический раствор) жидкость сохраняет свою равномерную гомогенную мутность;

9. Для чего нужен контроль при постановке реакции агглютинации?

Для сравнения реакции реакции агглютинации и феномена агглютинации с тем, где все тихо-мирно.

10. По каким признакам определяется степень агглютинации в пробирках?

В опытной пробирке жидкость станет прозрачной (или почти прозрачной), а на дне пробирки выпадает осадок, который при встряхивании пробирки разбивается на свободно плавающие в жидкости хлопья. В контрольной пробирке жидкость сохранит равномерную и гомогенную мутность.

(?) 11. Как производится оценка степени агглютинации?

(?) 12. Для чего необходим контроль в реакции агглютинации?

(?) 13. При какой степени агглютинации реакция считается еще положительной?

(?) 14. Какая агглютинация происходит раньше: 0- или Н-?

15. Какие компоненты участвуют в реакции преципитации?

Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:

а) преципитирующую сыворотку;

б) антиген в виде прозрачного раствора (экстракт из микробных
тел, из органов или из других патологических субстратов);

в) физиологический раствор;

г) набор специальных преципитационных пробирок.

16. Какова методика постановки реакции кольцепреципитации?

Для постановки реакции используют I %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе. Тщательно профильтрованный полностью прозрачный расплавленный агар разливают в чашки Петри слоем 0,5 см толщиной. После застывания в пластинке агара с помощью металлической трубочки вырезаются луночки диаметром 5-6 мм - одна в центре чашки и 4-5 по окружности на расстоянии 2 см от центральной. В цент­ральную луночку наливается сыворотка кролика, иммунизированного исследуемым антигеном, а в периферические - раствор исследуемого антигена и сравниваемых с ним веществ. Чашки помещаются в эксикатор с налитой на дно водой (для предупреждения высыхания) при комнатной температуре. Учет результатов реакции производится через 24, 48 и 72 часа.

Антитела из центральной луночки и антигены из периферических диффундируют, навстречу друг другу, и в участках, где создаются эквивалентные концентрации антител и антигенов, выпадает дугообразная полоса преципитации. Появление нескольких полос преципитации между центральной и периферическими луночками указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это ука­зывает на идентичность антигенов, содержащихся в этих луночках. Взаимное пересечение полос преципитации свидетельствует о серологи­ческой неидентичности антигенов.

17. Для каких целей используется реакция преципитации в агаре?

Реакция преципитации в агаре является одним из наиболее чувствительных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости (например, в бактериальных или тканевых экстрактах) и произвести анализ антигенного родства отдельных компонентов в смеси антигенов.

18. Какова методика постановки реакции преципитации в агаре?

Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:

а) преципитирующую сыворотку;

б) антиген в виде прозрачного раствора (экстракт из микробных
тел, из органов или из других патологических субстратов);

в) физиологический раствор;

г) набор специальных преципитационных пробирок.

Порядок работы

В преципитационную пробирку наливают 0,5 мл преципитирующей сыворотки, затем при помощи пастеровской пипетки наслаивают на сыворотку 0,5 мл раствора антигена. Пробирку при этом следует держать в наклонном положении, а после добавления антигена пробирку ставят в штатив (в вертикальном положении). При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется тонкое кольцо помутнения. Степень реакции оценивается по выраженности кольца и времени его появления. Обычно кольцо появляется в течение первых 3-10 минут.

19. В чем заключается сущность реакции пассивной гемагглютинации?

В настоящее время для диагностики многих заболеваний широко используется реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Она основана на способности эритроцитов адсорбировать на своей поверхности специфические микробные антигены или антитела к ним. Сенсибилизированные таким образом эритроциты агглютинируются в присутствии гомологичных антител или антигенов.

20. В чем заключается сущность реакции латекс-агглютинации?

Реакция латекс-агглютинации (ЛАГ) также является чувствительным и специфическим методом диагностики. Основным условием успешной постановки ЛАГ является строгое соблюдение количественных соотношений компонентов системы при постановке реакции, выполняемой микрометодом, в лунках на стекле: к 50 мкл исследуемого материала добавляют 10 мкл латекс-препарата, частички которого несут на себе специфические антитела. После перемешивания смесь в течение 10 мин встряхивают. Результаты учитывают по 4-х крестной системе. Положительной считают реакцию, оцененную не менее чем двумя крестами. Всего на постановку реакции и ее учет тратится-около 30-40 мин.

21. Какие преимущества имеет РПГА?

Вариантами использования РПГА являются реакция нейтрализации антигена (рНАг), реакция нейтрализации антител (рНАт), реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используются антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы. Можно использовать одновременно две взаймоконтролирующие однонаправленные реакции, например РПГА с антигенным диагностикумом и рНАг с антительным эритроцитарным диагностикумом.

22. Какие компоненты участвуют в РПГА?

Для постановки реакции пассивной гемагглютинации необходимо иметь:

1. Сенсибилизированные эритроциты, или эритроцитарный диагностикум (т.е. эритроциты, на которых адсорбированы антигены возбудителя) или эритроцитарный антительный диагностикум (т.е. эритроциты, на которых адсорбированы антитела к микробным антигенам). Метод сенсибилизации эритроцитов зависит от вида возбудителя или природы антител.

2. Исследуемую сыворотку (сыворотку больного или бактерионоси­теля, в которой определяют наличие антител к возбудителю) или дру­гой материал от больного, в котором предполагается наличие возбудителя или его антигенов.

3. Физиологический раствор.

4. Соответствующие контрольные системы (заведомо положительные и заведомо отрицательные) для большей, специфичности диагноза.

Для постановки РПГА используют либо круглодонные агглютинационные пробирки одинакового диаметра либо специальные полистироло­вые пластинки с луночками.

(?) 23. Что такое сенсибилизированные эритроциты?

Это эритроциты чувствительные к определенному антигену.

24. Как определяют результаты РПГА?

Учет реакции производят по четырехкрестной схеме:

++++ полная гемагглютинация, эритроциты равномерно устилают почти все дно пробирки, нередко в виде зонтика;

+++ почти все эритроциты агглютинированы и равномерно покры­вают дно пробирки;

++ наряду с равномерным агглютинатом на дне пробирки имеется осадок в виде маленького колечка или "пуговки";

+ большинство эритроцитов осело в центре дна пробирки в виде диска и лишь незначительное количество агглютинировалось с образованием мелких хлопьев;

—признаков агглютинации нет: эритроциты осели в виде маленького колечка или "пуговки" (диска) в центре дна пробирки.

25. Какова методика постановки реакции пассивной гемагглютинации?

Постановка опыта

Во все пробирки (луночки) разливают физиологический раст­вор: в 1-ю пробирку -0,9 мл, а в остальные - по 0,5 мл. Затем в 1-ю пробирку вносят 0,1 мл испытуемой сыворотки, перемешивают и пе­реносят 0,5 мл во 2-ю, вновь перемешивают и переносят из 2-й пробирки в 3-ю 0,5 мл и так далее до 7-й пробирки включительно. Из 7-й пробирки 0,5 мл жидкости выливают, 8-я пробирка служит контро­лем и поэтому сыворотки не содержит.

Эритроцитарный диагностикум перед использованием встряхивают до полного исчезновения осадка на дне и получения гомогенной взвеси. По ходу работы встряхивание часто повторяют. Эритроцитарный диагностикум разливают во все пробирки по 0,5 мл. после этого пробирки встряхивают и помещают на 1,5-2 часа в термостат при 37 °С, а затем учитывают результаты реакции (иногда через 16-20 часов).

26. Что такое комплемент?

Комплемент - большая группа взаимодействующих между собой белков и гликопротеинов крови, имеющихся у всех позвоночных (белки С1-С9, различные факторы и инактиваторы, всего около 20 компонентов).

Существует три пути активации системы комплемента:

а) Классический, инициируемый комплексом антиген-антитело;

б) Альтернативный, инициируемый бактериальными эндотоксинами, пропердином и различными другими агентами, но протекающий без учас­тия компонентов С1, С4 и С2;

в) Механизм С1 -шунта, реализуется при дефиците С4-компонента, требует активации С1-компонента.

(?) 27. Какую роль играет комплемент в реакциях иммунной сыворотки?

28. Как получают гемолитическую сыворотку?

Гемолитическую сыворотку получают иммунизацией кролика эритроцитами барана.

29. Какова методика постановки реакции гемолиза?

На чистое стекло наносят на расстоянии 1,5 см друг от друга две капли гемолитической сыворотки в разведении 1:300. На таком же расстоянии от второй капли наносят другой пипеткой каплю физиологического раствора. Во все три капли чистой пасте­ровской пипеткой добавляют по I капле 4%-ной взвеси отмытых бара­ньих эритроцитов. После этого в первую и третью капли добавляют по I капле комплемента (свежая сыворотка морской свинки) в разведении 1:10, а во вторую каплю вместо комплемента добавляют физиологичес­кий раствор в том же объеме. После этого содержимое всех капель тщательно перемешивают (перед каждым перемешиванием петля должна быть прокалена и остужена). Для ускорения наступления реакции стек­ла могут быть слегка подогреты высоко над пламенем спиртовки или в термостате 10 минут. Реакция гемолиза происходит только в первой капле, в которой содержатся все необходимые для этого ингредиенты: эритроциты, антитела (сыворотка) и комплемент. Во второй капле про­изойдет реакция агглютинации, так как в ней имеются антиген (эрит­роциты) и антитела (сыворотка), но нет комплемента. В третьей капле (эритроциты + комплемент; никаких видимых изменений не произойдет.

30. Что такое гемолитическая (индикаторная) система?

31. Если конечным результатом РСК является гемолиз - реакция положительная или отрицательная?

32. Какие компоненты участвуют в РСК?

Для постановки основного опыта РСК необходимы следующие ингредиенты:

а) антиген, рабочая доза которого уже оттитрована;

б) исследуемая сыворотка;

в) комплемент, рабочая доза которого должна быть также оттит­рована:

г) гемолитическая сыворотка с известным титром;

д) 3 %-ная взвесь отмытых эритроцитов барана;

е) физиологический раствор.

33.Для чего необходимо определение рабочих доз антигена и комплемента?

34. Как определяют рабочую дозу комплемента?

35. Почему испытуемая сыворотка должна быть инактивирована?

36. Как ставят основной опыт РСК?

37. Если в сыворотке больного отсутствуют антитела к антигену, ка­ким будет результат РСК?

38. Что называется титром гемолитической сыворотки?

39. В каком разведении берется в основной опыт гемолитическая сыворотка?

40. Какие контроли используются в РСК?

41. Какова классификация форм приобретенного иммунитета?

42. Каковы различия между искусственным активно и искусственным пассивно приобретенным иммунитетом?

43. Какой иммунитет создается при введении гамма-глобулина?

Пассивный, приобретенный.

44. Какие условия хранения иммунопрепаратов?

45. Как получают химические вакцины?

46. Как готовят анатоксины?

47. Как получают иммунные диагностические сыворотки?

48. Какими свойствами обладают иммунные сыворотки?

49. Как получают лечебно-профилактические сыворотки?

50. Как производят очистку лечебно-профилактических сывороток?

51. Какие преимущества имеет гамма-глобулин перед сыворотками?

52. В каких единицах дозируются антитоксические сыворотки?

53. В каких единицах дозируются анатоксины?

Одна антигенная единица анатоксина обозначается Limes flocculationis (Lf — порог флоккуляции); это то количество анатоксина, которое целиком связывается с одной антитоксической единицей антитоксина.

Антигенные свойства анатоксинов обозначают и в единицах связывания. Для определения ЕС необходимы испытуемый препарат анатоксина, стандартная антитоксическая сыворотка (с содержанием 0,1 ME в 1 мл), опытная доза токсина (вытитрованная к 0,1 ME стандартной сыворотки), белые мыши.

54. Каковы методы введения аллергенов?

Внутрикожно, накожно.

55. Каковы способы введения вакцин?

К основным методам вакцинации относятся: внутрикожный, подкожный, внутримышечный, безыгольный, аэрозольный и пероральный.

56. Как готовят аутовакцины, каково их назначение?

Аутовакцины

лечебные бактериальные вакцин, приготовляемые из бактерий, вызвавших заболевание и взятых от того же больного, для лечения которогоданная вакцина предназначена.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: