І. КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 11

Тема: ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ, ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ. СОСТАВ ПЕСТРОГО РЯДА ГИССА И СЕРЕДА РЕССЕЛЯ.

Цель работы: Научиться выявлять ферментативную активность бактерий на дифференциально-диагностических средах, ознакомиться с методикой определения ферментативной активности бактерий с помощью энтеротестов и СИБ.

Оборудование и материалы: Демонстративный материал.

І. КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Роль ферментов в жизнедеятельности бактерий. Все питательные вещества и любые элементы, подвергающиеся взаимодействиям и превращениям с участием бактерий, вступают в реакции при участии ферментов. Ферменты или энзимы – специфичные и эффективные белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. За каждое превращение одного соединения в другое ответственен особый фермент.

- Ферменты снижают энергию активации, обеспечивая протекание таких химических реакций, которые без них могли бы проходить только при высоких температурах, избыточном давлении, и при других нефизиологических условиях, неприемлемых для живой клетки.

- Ферменты увеличивают скорость реакции примерно на 10 порядков, что сокращает полупериод какой-либо реакции с 300 лет до одной секунды.

- Ферменты «узнают» субстрат по пространственному расположению его молекулы и распределению зарядов в ней. За связывание с субстратом отвечает определенный участок молекулы ферментативного белка – его каталитический центр. При этом образуется промежуточный фермент-субстральный комплекс, который затем распадается с образованием продукта реакции и свободного фермента.

Регуляторные (аллостерические) ферменты воспринимают различные метаболические сигналы в соответствии с ними изменяют свою каталитическую активность.

Эффекторные ферменты. Известно шесть основных классов ферментов, катализирующих следующие реакции: оксидоредуктазы – перенос электронов; трансферазы – перенос различных химических групп; гидролазы – перенос функциональных групп на молекулу воды; лиазы – присоединение групп по двойным связям и обратные реакции; изомеразы – перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных форм; лигазы – образование связей С-С, C-S, C-O, C-N, за счет реакций конденсации, сопряженным с распадом АТФ.

- Бактерии способны синтезировать все ферменты, необходимые для утилизации широкого спектра питательных субстратов. Определенный субстрат в среде вызывает синтез ферментов, обеспечивающих его катаболизм. В этом случае говорят об индукции катаболических ферментов индуцирующим субстратом (индуцибельные ферменты). Образование анаболических ферментов в процессах биосинтеза регулируется путем репрессии конечным продуктом (репрессибельные ферменты). Если в среде имеются сразу два субстрата, то бактерия использует субстрат, обеспечивающий более быстрый рост. Синтез ферментов для расщепления второго субстрата репрессируется; такой вариант известен как катаболитная репрессия. Ферменты, синтезируемые вне зависимости от условий среды, - конститутивные ферменты.

По ферментативной активности отличаются не только отдельные виды микробов, но и отдельные варианты одного вида. Они называются биоварами. В лабораторной практике учитываются не все ферменты, которые вырабатывают микробы, а только те по которым можно дифференцировать генетически близкие между собой виды. Наиболее чаще изучают ферменты, способные расщеплять углеводы (сахаролитические), белки (протеолитические), мочевину (уреазу), расщеплять лецитин (лецитиназу), ферменты, которые обуславливают окислительно-востановительные свойства микробов (дегидразы, каталазу, оксидазу), а так же токсины, которые разрушают эритроциты (гемолитические свойства)

Сахаролитическую активность выявляют на питательных средах, которые содержат определенный углевод или многоатомный спирт (в микробиологической практике углеводы и многоатомные спирты объединяют в одну группу). Под воздействием сахаролитических ферментов углеводы расщепляются до кислоты и газа (СО₂ Н₂, СН₄). Для выявления кислот к питательным средам добавляют индикатор. Накопление газов выявляют в полужидкой среде по появлению пузырьков газа в среде, разрывом среды, пенообразованием. Этот принцип положен в основу использования дифференциально-диагностических сред Ресселя, Гисса, Ендо, др.

На среде с крахмалом определяют способность микроорганизмов продуктировать фермент амилазу, которая сопровождается гидролизом крахмала - в случае добавления раствора Люголя к засеянной среде реакция на крахмал будет негативной (под действием йода среда не синеет).

На среде с молоком определяют способность микроорганизмов продуктировать фермент лактазу, которая расщепляет молочный сахар лактозу до кислоты или до кислоты и газа. При этом молоко свёртывается, образуется казеин.

Протеолитическую активность микроорганизмов определяют на средах которые содержат желатин, молоко, сыворотку крови, белок куриного яйца, кусочки вареного мяса, пептон.

Для выявления фермента желатиназы микробы засевают уколом в питательную среду (мясопептонный желатин), инкубируют при температуре 22⁰ С или 37⁰ С в течении 1 до 20 суток. Характер разжижения желатины, вызванный различными микроорганизмами разный.

В среде с молоком микроорганизмы, образующие протеолитические ферменты, пептонизируют казеин. Поэтому жидкая молочная среда становится полупрозрачной, похожа на сыворотку.

Протеолитически активные микробы гидролизируют белки до индола, сероводорода, аммиака. Индол образует вследствие расщепления аминокислоты триптофан. Для выявления индолообразования в пробирку с средой, в которую засеяна культура исследуемых микроорганизмов, вносят индикаторную полоску, пропитанную щавелевой кислотой. Под действием индола полоска приобретает бледно-розовый цвет. Сероводород можно определить при помощи индикаторной ленты, пропитанной, пропитанной раствором ацетата свинца. Под действием сероводорода образовывается сульфид свинца – вещество черного цвета, вследствие чего полоска тоже темнеет до черного цвета.

Гемолитические особенности микробов, т.е. способность разрушать эритроциты, определяют на питательных средах с кровью. Различают два вида гемолиза: альфа- и бета- гемолиз. Если первый вид, то на кровяном агаре образовывается зеленая зона, вследствие преобразования гемоглобина в метгемоглобин. Во втором случае образуется прозрачная зона вокруг колонии.

Лецитиназную активность, способность разрушать лецитин мембран клеток определяют на средах с желтком куриного яйца. Если микроорганизм образует фермент лецитиназу, вокруг колонии образуется радужный венчик.

Фермент плазмокоагулазу изучают на среде, которая содержит цитратную плазму крови. Через 2-3 часа культивирования при 37⁰ С плазма свертывается (не выливается из перевернутой пробирки).

Уреазную активность определяют на средах, которые содержат мочевину. Поскольку уреаза расщепляет мочевину до углекислого газа и аммиака (углекислый газ плохо растворяется в воде, аммиак – очень хорошо), среда приобретает щелочную реакцию, на что покажет изменение цвета индикатора.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Задание 1. Записать и выучить алгоритм «Определения сахаролитических свойствмикроорганизмов на средах Гисса»

‑ сравните по цвету контрольные (без роста культуры) и исследуемые (с ростом культуры) пробирки среда Гисса;

‑ обратите внимание, в какой пробирке изменился цвет среды, сделайте вывод о том, какие углеводы расщепляет культура микроорганизмов;

‑ обратите внимание на наличие пузырьков газа;

‑ в полужидких средах Гисса определяют также подвижность микроорганизмов. Неподвижные формы микроорганизмов растут только вдоль укола, который имеет цилиндрическую или конусовидную форму, среда остается прозрачной.

‑ подвижные микробы способствуют равномерному помутнению всей среды;

Задание 2. Учесть ферментативную активность кишечной палочки и золотистого стафилококка на средах Гисса и МПА (пробы на сероводород и индол). Отметить результаты в протоколе.

Среды Гисса дифференциально-диагностические питательные среды для выявления ферментативной активности бактерий (кишечной группы). Содержат 1% пептонную воду, 0,5% раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, манит, сахароза и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе NaOH). Среда при рН 7,2-7,4 – бесцветна, при ферментации углеводов приобретает красный цвет. В пробирки со средой помещают поплавок (небольшая трубочка, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при расщеплении углеводов. При биохимической типизации, помимо изменения цвета сред, изучают способность бактерий образовывать сероводород, индол и т. д. Принадлежность культуры к определенному виду бактерий по изменению пестрого ряда сред устанавливают по таблицам или определителям, которые имеются в учебных пособиях по практическим занятиям.

Учет изменений «пестрого» ряда Гисса и МПА.

Заключение:

Задание 2. Учесть рост кишечной палочки на среде Эндо. Чашку Петри с ростом культуры зарисовать.

Заключение:

Среда Эно. предназначена для выделения энтеробактерий, обнаружения эшерихий. Состоит из питательного агара, 1% лактозы и индикатора – основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или имеет бледно-розовую окраску. Кишечная палочка ферментирует лактозу с образованием альдегидов, фуксин-сернистоя кислота переходит в альдегид-сернистое соединение с освобождением фуксина, который окрашивает колонии и среду в ярко-красный цвет.

Задание 3 Учесть рост бактерий на среде Ресселя. Описать изменения в среде, сделать заключение.

Среда Ресселя состоит из МПА, 0,1% -го раствора глюкозы, 1% -го раствора лактозы и индикатора. Ее разливают в пробирки так, чтобы в нижней части образовался столбик, а в верхней – скошенная поверхность. Микробы, ферментирующие оба углевода, изменяют цвет среды как в столбике, так и на скошенной поверхности, а при образовании газа в столбике происходит образование пузырьков газа или разрыв среды. Микробы, ферментирующие глюкозу до кислоты и не ферментирующие лактозу, изменяют цвет среды только в столбике, цвет скошенной поверхности не меняется.

Среда Плоскирева – дифференциально-диагностическая и селективная, способствует лучшему росту некоторых бактерий (возбудители брюшного тифа, паратифов, дизентерий) и подавляет рост других (кишечная палочка и пр.). Содержит питательный агар с лактозой, бриллиантовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными солями и индикатором (нейтральный красный). Лактозонегативные колонии вырастают бесцветными, лактозопозитивные – красными. На некоторых модификациях среды Плоскирева выявляется еще и способность сальмонелл выделять сероводород: выросшие колонии чернеют.

Задание 4. Изучить энтеротесты и СИБ (система индикаторная бумажная), ознакомиться с методикой определения ферментативной активности бактерий с помощью энтеротестов и СИБ.

Контрольные вопросы

1. Метаболизм бактерий.

2. Роль ферментов в жизнедеятельности бактерий.

3. Эндоферменты и экзоферменты.

4. Определение ферментативной активности.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: