ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

В ходе практики я познакомился со следующими методами:

1. Прижизненное окрашивание митохондрий красителем паранитротетразолием фиолетовым

2. Иммуноцитохимический анализ с последующей локализацией исследуемого белка в клетке с помощью флуоресцентной микроскопии

3. Определение флуоресценции митохондрий на спектрофлуориметре PERKIN ELMER MPF-448

4. Спектрофотометрическое определение функционального состояния митохондрий по активности маркерного фермента сукцинатдегидрогеназы с использованием красителя паранитротетразолия фиолетового на спектрофотометре SPECORD M40

5. Использование программного обеспечения RasMol 2.6 для изучения структуры белков

6. Очистка белков на автоматическом хроматографе HPLC

Сущность методов, освоенных на практике.

Прижизненное окрашивание митохондрий

паранитротетразолием фиолетовым (пНТФ).

Данное вещество легко восстанавливается дегидрогеназами, участвующими в цикле Кребса. Продукт восстановления красителя – нерастворимое ве-щество ярко-красного цвета. Митохондрии при этом можно наблюдать живыми, вести их подсчёт, определять степень агрегации. По интенсивности окраски определяется функциональное состояние митохондрий, функцио-нальные митохондрии окрашиваются в ярко-розовый цвет. Окрашивание митохондрий начинается через несколько минут, при наблюдении старых митохондрий целесообразно добавлять в препарат NADH. Увеличение оптической плотности при длине волны 530 нм пропорционально активности ферментов-дегидрогеназ цикла Кребса (в частности, маркерного фермента митохондрий сукцинатдегидрогеназы) и используется для определения их активности. Митохондрии, окрашенные пНТФ, выглядят под микроскопом следующим образом:

Иммуноцитохимический анализ.

Данный метод предназначен для точной локализации определённых белков в отдельных клетках и их компартментах. Основан на связывании с исследуемым белком антител, меченых красителем, содержащим флуофор. В дальнейшем препарат изучается методами флуоресцентной микроскопии.

При использовании данного метода препарат готовится следующим образом:

1. Исследуемые клетки предварительно культивируются в чашке Петри на покровных стёклах
2. Перед исследованием покровные стёкла с образцами выдерживаются в растворе антител к изучаемому белку
3. Клетки фиксируются парами формальдегида
4. К препарату добавляется раствор глицерина и буфера для предотвращения испарения воды
5. Покровное стекло приклеивается к предметному стеклу, смазываясь клеем по краям

Используемые при исследовании микроскопы имеют несколько режимов. В «оптическом» режиме (в опыте режим TL-DIC) осуществляется поиск клеток, в режиме FLUO изучается их флуоресценция. Изображение с микроскопа выводится на экран компьютера.

Очистка белков методом автоматической хроматографии

(на примере использования для очистки мембранных белков автоматического хроматографа HPLC).

При использовании данного прибора для ионообменной хроматографии разные белки из-за различного заряда поверхности глобулы выходят из смеси белков при разных концентрациях солей (как при высаливании). Концентрация белка измеряется при длине волны 280 нм. В специальные гнёзда прибора устанавливаются сосуды с двумя буферными растворами (буфер А без соли и буфер B с солью (NaCl)), которые в задаваемых с помощью компьютера соотношениях смешиваются внутри прибора в заданное время. Образующийся раствор проходит через смесь белков (например, гомогенат), в результате белок отделяется от смеси, если заряд его глобулы соответствует концентрации соли в растворе (и суммарному заряду соответствующих ионов раствора). Данные о концентрации белка непрерывно выводятся на компьютер в виде графика зависимости напряжения, поступающего с фотоэлемента спектрофотометра, от времени. Напряжение в данном случае прямо пропорционально концентрации белка в сходящем растворе. При выделении мембранных белков следует учитывать, что используемый для их выделения детергент тритон сходит первым и также даёт поглощение при длине волны 280 нм.

Спектрофотометрическое определение активности ферментов

на спектрофотометре SPECORD M40 и спектрофлуориметре

PERKIN ELMER MPF-448.

Рассмотренный спектрофотометр позволяет определять создаваемое образцом поглощение света в различных диапазонах волн. Результат запи-сывается в виде графика зависимости поглощения света от времени. Изменение поглощения света определённой длины волны может свидетельство-вать о наличии активности фермента. Данные выводятся на экран компьютера.

Спектрофлуориметр позволяет измерять активность ферментов по изменению спектра флуоресценции. При спектрофлуориметрии сигнал от вещества усиливается в несколько раз для обеспечения точности измерения. Характеристикой вещества при этом является длина волны возбуждения – такая длина волны, что при облучении данного вещества с этой длиной волны начинается флуоресценция вещества в определённом диапазоне электромагнитного излучения.

ЛИТЕРАТУРА

1. А.Г. Белякович. Изучение митохондрий и бактерий с помощью соли тетразолия п-НТФ. Пущино: 1990 г.

2. Ресурсы сайта Института биофизики клетки РАН (url: www.ibc.psn.ru)

3. Ресурсы сайта Института белка РАН (url: www.proptes.ru)

4. Ресурсы сайта Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (url: www.web.iteb.psn.ru)

5. Ресурсы сайта Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. К.Г. Скрябина (www.ibpm.ru)

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: