II.1. Прямые иммуноанализы

Прямыми называют анализы, в которых метку присоединяют либо к заданному Аг, либо к специфичному против заданного Аг АТ непосредственно. Прямой вариант используют в гомогенных системах и некоторых гетерогенных: в конкурентном, ингибиторном, сэндвич–ИФА и иммуноферментометрическом анализе.

Конкурентный ИФА Если целевой Аг — какое–либо вещество, подлежащее определению в биологических жидкостях, то на твёрдой фазе сорбируют АТ к этому Аг. Аг–препарат метят ферментом. При проведении анализа к твёрдой фазе добавляют испытуемую биологическую жидкость и меченый Аг. Последний конкурирует с Аг в испытуемой пробе за иммобилизованные на твёрдой фазе АТ. В результате реакции ферментативная активность на твёрдой фазе оказывается обратно пропорциональной концентрации определяемого в пробе Аг.

Ингибиторный ИФА В ингибиторном ИФА на твёрдой фазе иммобилизуют Аг. Растворимые АТ как реагент конъюгированы с ферментом. Определяемый Аг в испытуемой пробе конкурирует с иммобилизованным на твёрдой фазе Аг за растворимые АТ. В итоге ферментативная активность, измеряемая на твёрдой фазе, обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе.

Сэндвич–ИФА (рис. П.8). Сэндвич–ИФА разработан для Аг, на которых есть не менее двух неперекрывающихся эпитопов. Против обоих эпитопов получают в качестве реагентов специфичные АТ. АТ к одному из эпитопов сорбируют на твёрдой фазе. Испытуемую пробу добавляют к твёрдой фазе, инкубируют, отмывают. После отмывки вносят конъюгат АТ ко второму эпитопу с ферментом. Ферментативная активность, остающаяся на твёрдой фазе, прямо пропорциональна содержанию Аг в пробе.

Сэндвич–ИФА не требует препаратов очищенных Аг, что выгодно отличает его от конкурентных и ингибиторных методик, поскольку чистые Аг всегда дороги. Чувствительность сэндвич–ИФА потенциально выше, чем конкурентных и ингибиторных. Аналогичная технология применима и с использованием одного АТ (и на твёрдой фазе, и в составе конъюгата с ферментом) в случаях наличия на целевом Аг повторяющихся эпитопов. В современных модификациях ту же технологию называют ловушечным ИФА - АТ на твёрдой фазе ловят свой Аг из смеси веществ в биопробе.

Иммунометрические анализы (рис. П.9). При иммунометрических анализах к испытуемой пробе, предположительно содержащей определяемый Аг, в пробирку добавляют заведомый избыток меченых АТ. Затем к этой смеси добавляют заведомый избыток иммобилизованного на мелкодисперсной твёрдой фазе Аг. После инкубации отделяют растворимую фракцию (супернатант) и в ней измеряют ферментативную активность (если метка — фермент). Ферментативная активность супернатанта прямо пропорциональна содержанию Аг в испытуемой биопробе. Благодаря использованию избытка реагентов этот метод более чувствителен, чем конкурентный ИФА, и его аналитические возможности приближаются к предельным.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: