Проточная цитометрия

За прошедшее десятилетие проточная цитометрия становится все более актуальным и востребованным методом и на территории СНГ. На данный момент она заняла свои позиции не только в научно-исследовательской практике, но и как «золотой стандарт» клинической иммуноцитологии. Проточная цитометрия заняла прочные позиции в различных областях применения, как клинических: иммунология, онкология, онкогематология (включая диагностику, оценку эффективности лечения, мониторинг пациентов, входящих в группу риска), трансплантология, общая гематология, диагностическое типирование клеток и др.; так и исследовательские: клеточная кинетика, клеточная энзимология, изучение механизмов действия различных иммуномодуляторов и других биологически активных веществ, клеточная физиология, генетика и др. Постоянно увеличивается возможности анализа различных параметров клеток, их морфологии, клеточного цикла, функциональные возможности по автоматизации и ускорению анализа. Этому способствует и модификация и совершенствование технических возможностей новой аппаратуры, и повышение их доступности, постоянно совершенствующая реагентная база.     Первый патент на устройство, которое легло в основу проточной цитометрии, использующее принцип сопротивления Култера было зарегистрировано в США в 1953 году, его автор Wallace H. Coulter. Адсорбционные методы на тот момент были распространены гораздо шире флуоресцентных. Первый прибор, использующий флуоресценцию, был создан в 1968 году Wolfgang Göhde из University of Münster и почти сразу получил коммерческое использовани немецким разработчиком и изготовителем Партеком (Partec) в Геттингене. Новый метод быстро получил свое признание и развитие, и в период 70 х годов появилось несколько инструментов для проточной цитометрии включая Cytofluorograph (1971) от Bio/Physics Systems Inc., PAS 8000 (1973) от Partec, первые FACS оснащают датчиками от Becton Dickinson (1974), ICP 22 (1975) от Partec/Phywe и Epics от Коултера (1977/78). Изначально методику называли пульсовой цитофлоуметрией (на немецком: ''Impulszytophotometrie''). Только 20 лет спустя в 1988, на Конференции американского Технического Фонда в Пенсаколе, штат Флорида, название было изменено на "проточную цитометрию", и именно в этот термин быстро стал популярным.     Принцип метода: Принцип проточной цитометрии состоит в оптическом анализе клеток или их частей в гидродинамически узконаправленном потоке, который пересекает сфокусированный лазерный пучок. При этом возможен одновременный мультипараметрический анализ физических и/или химических особенностей до тысячи частиц в секунду событий. Оптические сигналы фиксируются системой фотоумножителей и зеркал. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют: • рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток). • рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток). • интенсивность флуоресцентных сигналов (возможно нескольких флуоресцентных красителей) • поляризацию флуоресценции и время пролета частицы. Эти показатели позволяют оценить степень вязкости мембран клеток, которая меняется в зависимости от их функционального состояния, и степень асимметричности клеток или исследуемых органелл   Для полноценного анализа необходимо: · для анализа необходимы гомогенные суспензии изолированных клеток или частиц; · клетки или ядра должны иметься в достаточном количестве; · для устранения эффектов, связанных с возможной агрегацией клеток, необходимо использовать всю доступную информацию, например данные по рассеянию света в объеме и отношение площади пика к его ширине. · полученные данные должны быть быть записаны, проанализированы математически и представлены в виде гистограмм.   Преимущества метода • Возможность высокой автоматизации метода • Высокая скорость анализа • анализ большого количества клеток (до 108 клеток) • использование статистических и математических моделей, которые увеличивают возможности анализа результатов • измерение параметров малых субпопуляций и редко встречающихся частиц. • объективное измерение интенсивности флуоресценции • технические возможности современных приборов позволяют на одном образце проанализировать несколько субпопуляций клеток по набору морфологических характеристик и флуоресценции нескольких видов моноклональных антител. • Возможность производить сортинг клеток по определенным параметрам [2-4]. Возможности проточной цитометрии в иммунологии: Основной задачей проточной цитометрии в иммунологии является иммунофенотипирование нормальных и патологических иммунокомпетентных клеток.     Возможности проточной цитометрии в этом направлении: • Практически неограниченная возможность иммунофенотипирования лимфоцитов, включая определение количества как основных популяций, так и малых субпопуляций, в том числе по продукции специфических цитокинов (как в случае с Тh1 и Тh2 типа); • анализа функциональной активности процессов клеточной активации. • определения маркеров пролиферативной активности клеток иммунной системы (Ki-67, PCNA, Cyclin D3); • оценки внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями; • иммунофенотипирования острых лейкозов и лимфом; • анализа клеточного цикла с определением распределения клеточной популяции по фазам цикла (ДНК-цитометрия); • детекции и мониторирования минимальной резидуальной болезни (MRD); • анализа маркеров апоптоза (аннексина V, CD95 Fas/APO-1, CD95L, Bcl-2, P53). • Исследование фагоцитоза, поглотительной способности фагоцитов, бактерицидной и фунгицидной функции фагоцитов. • Исследование продукции активных форм кислорода     Остановимся подробнее на основных возможностях. Одной из задач клинической иммунологии является оценка иммунного статуса. Она может включать в себя: иммунофенотипирование лимфоцитов, функциональнальная активность лимфоцитов, оценка гуморального иммунитета, активность фагоцитоза, и системы комплемента, и оценка интерферонового статуса. В настоящее время с помощью моноклональных антител идентифицировано около 166 поверхностных антигенов лейкоцитов. Дифференцировочные лейкоцитарные антигены обозначаются как «CD» (кластер дифференцировки) и имеют соответствующий номер. Анализируя картину поверхностных дифференцировочных маркеров, можно определить популяцию и субпопуляцию клеток, стадию их дифференцировки и активации; функцию клеток и их взаимодействие с другими клетками. В минимально иммунологическое обследование входит определение общих Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т-цитотоксических лимфоцитов, натуральных (естественных) киллеров. Наиболее важными поверхностными маркерами являются: для определения зрелых Т-лимфоцитов – CD3, Т-хелперов/индукторов – CD4, Т-цитотоксических лимфоцитов – CD8; В-лимфоцитов – CD19, CD20 и CD22; натуральных киллеров (NK) – СD16, CD56 и СD57.     Для оценки иммунного статуса при иммунофенотипировании лимфоцитов наряду с основными пятью популяциями целесообразно расширить анализ за счет малых субпопуляции лимфоцитов и пулов активированных клеток. Технические и методические возможности для этого постоянно расширяются и усовершенствуются. Так, если ранее для определения Т-цитотоксических лимфоцитов считалось достаточным использовать только один маркер CD8, то согласно современным представлениям необходимо одновременное исследование четырех маркеров: CD8, CD4, CD3 и CD45. Реализация такого подхода возможна только при использовании многоцветного цитометрического анализа.     Оценка функциональной активности лимфоцитов имеет важное значение, так как часто при многих заболеваниях и вторичных иммунодефицитах наблюдается нормальное количественное содержание этих клеток, но их функции зачастую угнетены /увеличены/ в значительной степени, и это может являться определяющим звеном в патогенезе того или иного заболевания. Наиболее часто используют маркеры активации: CD25 (рецептор интерлейкина-2), CD38, CD69, CD71 (трансферриновый рецептор), CD122, анти-HLA-DR, молекул адгезии – CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD54, CD59, дендритных клеток – CD11c+CD123+ и т. д. Важно, что с помощью цитометрии можно исследовать как поверхностные, так и внутриклеточные маркеры и сигнальные молекулы.   Фагоцитоз – есть множество подходов по изучению характеристик фагоцитоза в проточной цитометрии. Одним из них является измерение экспрессии молекул адгезии CD11b, CD18, CD62L, измерение мобилизации внутриклеточного кальция с помощью красителей Indo 1, Fluo3, Fura2, обрзаования активных форм кислорода по реакции дихлорфлюоресцина или дигидроданидом с перекисью водорода. Поглотительную способность можно измерить по флуоресцеции меченных микроорганизмов или частиц латекса. Преимуществом метода является способность оценить избирательную поглотительную активность для нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов.   К оценке функциональной активности можно отнести измерение процессинга белков и презентации их пептидов на поверхности моноцитов. Для этого есть опыт использования меченного флуорохромами бычьего альбумина. Нарушение процессинга блеков на поверхности моноцитов является диагностическим признаком некоторых первичных иммунодефицитов (синдром «голых лимфоцитов», синдром Чедиака-Хигаси).   Исследование цитокинов, интерферонового статуса востребовано в исследовательских целях в большей степени, чем в диагностических. Так известно, что Th1-цитокины (называемые также цитокинами 1-го типа) и Th2-цитокины (цитокины 2-го типа) относятся к группам цитокинов, продуцируемых двумяразличными субпопуляциями мышиных CD4+ Т-клеток, которые определяют направление ответа на антиген в сторону гуморального или клеточно-опосредованного типа иммунного ответа. Было показано, что Th1 и Th2-цитокины способны продуцировать не только CD4+ Т-клетки, но также и CD8+ Т-клетки, моноциты, естественные киллеры, В-клетки, эозинофилы, тучные клетки, базофилы и другие клетки. К цитокинам 1-го типа относят IL2, IFNγ, IL12 и TNFβ, к цитокинам 2-го типа – IL4, IL5, IL6, IL10 и IL13. Th1 клетки, но не Th2, продуцируют IL2, IFNγ и TNFβ, в то время как Th2лимфоциты, но не Th1, секретируют IL4, IL5, IL6 и IL10. Различные профили цитокинов соответствуют различным функциям эффекторов иммунной системы. Th1 клетки обеспечивают запуск клеточно-опосредованного эффекторного ответа. Th2-лимфоциты – основные клетки, участвующие в регуляции развития В-клеток и усиливающие гуморальный ответ, такой как продукция антител, преимущественно IgE В-клетками. Оба типа Th клеток оказывают влияние друг на друга, посредством продуцируемых ими цитокинов. Некоторые полученные данные свидетельствуют о том, что метод проточной цитометрии, на ряду с общепринятым методом оценки продукции цитокинов методом иммуноферментного анализа, позволяет адекватно оценить синтез и продукцию цитокинов на уровне клетки и открывает новые возможности в оценке изменений в цитокиновой сети при различных патологиях. Определение количества клеток с внутриклеточной и мембранной формами этого цитокина и сопоставление данных проточной цитометрии с данными, полученными методом ИФА, могут характеризовать состояние хронического заболевания в настоящий момент и в комплексе с другими диагностическими исследованиями определить тактику ведения пациентов.   Исследование процессов апоптоза, некроза, аутофагии и механизмов их регуляции в научно-исследовательских целях так же актуально. Для этих целей можно использовать наборы для детекции таких факторов как: АРО2.7 - антиген (также называемый 7А6), который появляется на мембране митохондрий апоптозных клеток. Annexin V -На ранней стадии апоптоза целостность клеточной мембраны сохраняется, однако происходит перестройка ее фосфолипидных компонентов и на поверхности клетки появляется фосфатидилсерин. Аннексин V способен связываться с фосфатидилсерином в присутствии кальция. Одновременное окрашивание аннексином V-FITC и PI (или 7-AAD) позволяет отделить погибшие клетки (двойное окрашивание) от клеток, только что вступивших на путь апоптоза. Каспаза-3 - один из основных участников передачи апоптозного сигнала от Fas-рецептора. CD 95 (Fas или APO1) – трансмембранный гликопротеин, принадлежащий к семейству фактора некроза опухолей. Связывание этой молекулы с Fas-лигандом приводит к индукции программируемой клеточной гибели. CD95 представлен на CD4+, CD8+, B-лимфоцитах. При активации клеток экспрессия этой молекулы увеличивается. Антиапоптотические и проапоптические факторы факторы (Bcl-xL и Bcl-2, BaxиBad) –Эти факторы способны ингибировать или активировать процессы, ведущие к клеточной гибели. [16,17].   В последне десятилетие шквал исследований касался системы врожденного иммунитета, в том числе системы рецепторов TLR. В 2011 году за открытие вэтой области была присуждена Нобелевская премия. Широкий спектр лигандов TLR и представленность этих рецепторов на многих клетках способствуют вовлечению TLR в патогенез многих заболеваний. Дефекты в системе TLR могут приводить к развитию тяжелых инфекционных заболеваний (сепсис, менингит), аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии. Дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от TLR, лежат в основе повышенной чувствительности к инфекциям или аллрегическим заболеваниям.. Количество выявленных связей различных патологий с нарушениями в системе TLR растет. В связи с этим необходимы адекватные и надежные методы оценки компонентов системы TLR для выявления иммунодефицитных состояний, связанных с нарушениями функциональной активности TLR, которые могут быть воспроизведены в условиях стандартной клинической лаборатории. К основным подобным методам относится и проточная цитометрия, которая способна изучить низкую экспрессию толл-подобных рецепторов на отдельных популяциях иммунокомпетентных и дендритных клетках.

Принцип метода.

Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Суспензия клеток под давлением подается в проточную ячейку, где за счет разности давлений между образцом и обтекающей жидкостью клетки, находясь в ламинарном потоке жидкости, выстраиваются в цепочку друг за другом (т.н. гидродинамическое фокусирование).

Клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки регистрируют флюоресценцию и рассеяное лазерное излучение каждой клетки. Полученный сигнал передается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков и гистограмм.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: