Недостатки молекулярно-генетических методов.

1. Отсутствие международных протоколов по молекулярно-генетической диагностике различных нозологических форм заболеваний.

2. Необходимость разработки новых подходов к клинической интерпретации получаемых результатов. В этиологической диагностике заболеваний в настоящее время по-прежнему существуют «золотые стандарты», в основу которых положены культуральный или микроскопический методы исследования. Для постановки этиологического диагноза необходимы положительные результаты культурального и микроскопического методов, результаты молекулярно-генетических методов в настоящее время оцениваются как ориентировочные.

Следует помнить, что выявление в клинических образцах ДНК сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов может не означать наличия патологического процесса и поэтому не может быть автоматически интерпретировано как диагноз, особенно на фоне благополучной клинической картины у пациента.

По этой же причине следует с осторожностью использовать молекулярно-генетические методы для анализа образцов с полимикробным сообществом (испражнения, материал из верхних дыхательных путей, материал из гениталий).

3. Высокая стоимость оборудования. Для проведения молекулярно-генетических исследований необходимо комплексное оснащение лаборатории, включающее термоциклер, устройство для ДНК-электрофореза, трансиллюминатор, шейкеры, центрифуги, холодильники, дозаторы, секвенатор, гибридизационную камеру и другое оборудование.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ БАКТЕРИЙ

1. Белки фимбрий, адгезины, компоненты секреторной системы изучают следующим образом:

– клетки дезинтегрируют ультразвуком;

– белки осаждают;

– проводят диализ для освобождения от балласта;

– выделяют очищенный белок при помощи жидкостной хроматографии;

– проводят электрофорез в полиакриламидном геле;

– идентифицируют белок с использованием биомаркеров (меченых поликлональных антител);

– изучают белок: определяют молекулярную массу методом масс-спектрометрии, 3D-структуру методом рентгеноструктурной кристаллографии.

2. Фимбрии выявляют с помощью:

– негативного контрастирования с последующей электронной микроскопией (рис. 41);

– изучения адгезии к поверхности культур клеток Hep2 и др.;

– постановки маннозозависимой реакции гемагглютинации с эритроцитами разных видов животных: при добавлении эритроцитов к суспензии бактерий в присутствии 1% раствора D-маннозы происходит склеивание эритроцитов с образованием «зонтика».

3. Гены, кодирующие бактериальные гликаны (пептидогликан, капсульные полисахариды, липополисахариды, системы гликозилирования белков), определяют с помощью сравнительного компьютерного анализа секвенированного генома микроорганизма и геномов хорошо изученных микроорганизмов. Функции генов подтверждают клонированием этих генов в E. coli или нокаутируют эти гены с использованием сайт-специфического мутагенеза.

4. Поверхностные структуры клеточной стенки изучают с помощью сканирующей атомно-силовой микроскопии высокого разрешения (рис. 42).

Капсула.

Наличие капсулы определяют окраской по Бурри-Гинсу (негативное контрастирование), по Книге, в реакции иммунного набухания.

Химический состав капсулы и других гликанов определяют путемразделения компонентов с использованием жидкостной хроматографии или капиллярного электрофореза, затем идентифицируют компоненты масс-спектрометрией.

Серологические варианты капсульных антигенов или ЛПС выявляют в серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции латекс-агглютинации).

Патогенные свойства капсулы определяютпутем введения капсульного вещества лабораторным животным (биологический метод), что может индуцировать образование абсцессов.

6. Токсигенность - свойство бактерий продуцировать и выделять во внешнюю среду экзотоксины (дифтерийный, ботулинистический, токсин Clostridium difficile, холерный, стафилококковый и др.), играющие решающую роль в развитии заболеваний.

Если существует несколько серологических вариантов экзотоксина, то определяют его серотип. Определение серотипа токсина имеет важное значение для назначения адекватной серотерапии (лечения сыворотками). Так при ботулизме определение типа токсина позволяет использовать моновалентную сыворотку и сокращает количество чужеродного лошадиного белка, вводимого в организм. Серотипы экзотоксинов выявляют с использованием одного из следующих методов:

– ИФА;

– реакции преципитации;

– реакции обратной пассивной гемагглютинации;

– иммунохроматографии с использованием антител, меченных коллоидным золотом;

– реакции нейтрализации на животных или в культуре клеток.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: