КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ

Цель:

1. Ознакомиться с основными, наиболее часто употребляемыми питательными средами, методами их приготовления и культивирования микроорганизмов

2. Выполнить I этап выделения чистой культуры аэробов

Материалы и оборудование: бактериологическая петля, предметные и покровные стекла, пробирки, ватные пробки, чашки Петри, шпатели, питательные среды, спиртовка или газовая горелка.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Известно значительное количество питательных сред, используемых для культивирования и поддержания (сохранения) микроорганизмов.

Питательные среды – это среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые при­меняются для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Еще в 1930 году их было классифицирова­ны не менее двух тысяч наименований, но число ингредиентов, яв­ляющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико, а их композиции создаются на определенных общих принципах.

Для размножения любых бактерий необходимо обеспечить подходящее биофизическое окружение и биохимические питательные компонен­ты.

Любая питательная среда должна соответствовать следующим требованиям:

· содержать все необходимые для роста питательные ве­щества в легко усвояемой форме;

· иметь оптимальную влажность,

· вяз­кость,

· рН,

· быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной.

Питательные среды должны иметь определенную реакцию, являющуюся оптимальной для изучаемого микроба. В большинстве случаев бактерии хорошо растут в слабощелочной (pH=7,2-7,4), а грибы – в слабокислой (pH=6,8-4,5) среде.

Для роста автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно просты: во­да, двуокись углерода и соответствующие неорганические соли. На­пример, бактерии рода Nitrobacter ассимилируют СО₂ и получают энергию путем окисления нитритов в нитраты.

Гетеротрофные бакте­рии получают энергию в результате окисления (диссимиляции) вос­становленных углеродных соединений.

Гетеротрофные бактерии используют органические соединения в двух целях:

1) в качестве источника энергии; при этом органическое вещество окисляется или расщепляется с высвобождением энергии и образованием ряда конечных продуктов типа СО₂, органических ки­слот и др;

2) в качестве субстратов, ассимилируемых непосредст­венно с образованием клеточных компонентов или для их синтеза в реакциях, требующих затрат энергии.

Так, E.coli способна к росту на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Молочнокислые же бактерии растут на сложных средах, содержащих в качестве добавок ряд органических соединений (витамины, амино­кислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать само­стоятельно. Такие соединения называются факторами роста.

Орга­низмы, которые нуждаются в их добавлении к ростовой среде, назы­ваются ауксотрофными по соответствующим соединениям.

Другая группа организмов, способная к росту на простых средах, содержащих источник углерода и энергии, а также набор основных биогенных элементов, получила название прототрофных.

Выбор питательной среды зависит в значительной степени от целей эксперимента, а существующая классификация питательных сред учи­тывает характеристику их следующих особенностей.

По составу пи­тательные среды делятся на натуральные и синтетические.

Нату­ральными называют среды, которые состоят из продуктов раститель­ного или животного происхождения, имеющих неопределенный хи­мический состав. Примерами питательных сред такого типа являются среды, представляющие собой смесь продуктов распада белков (ка­зеина, мышц млекопитающих), образующихся при их гидролизе. Ки­слотный (НС1) гидролиз белков используется для приготовления пол­ных гидролизатов. Действие ферментов типа трипсина, панкреатина, папаина приводит лишь к частичному (неполному) гидролизу белков, в результате чего образуются пептоны. Как правило, на пептонных питательных средах микроорганизмы растут лучше, чем на питатель­ных средах, приготовленных из полных гидролизатов или смесей аминокислот. При ферментативном гидролизе, вероятно, сохраняются лабильные факторы роста. Кроме того, многие микроорганизмы луч­ше размножаются на средах, содержащих небольшие пептиды, потому что их они могут усваивать непосредственно, а отсутствующие ами­нокислоты - нет. Обычно в составе такой среды ферментативный гидролизат белка обеспечивает потребность в таких источниках азота, как аминокислоты, углеводы (глюкоза), используется как источник углерода и энергии, соли удовлетворяют потребности бактерий в не­органических ионах, а дрожжевой экстракт обеспечивает потребности в витаминах. К питательным средам неопределенного состава можно отнести и среды, полученные на основе растительного сырья: карто­фельный агар, томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои сена и соломы и др. Основное назначение таких питательных сред - выделение, культивирование, получение биомассы и поддер­жание культур микроорганизмов.

К числу сред неопределенного состава относят и среды полусинте­тические. В такую среду вносят известные соединения как явно необ­ходимые; а также добавляют небольшое количество дрожжевого или кукурузного экстракта (или любого другого природного продукта) для обеспечения неизвестных потребностей роста. Такие среды часто ис­пользуются в случае промышленного культивирования биологических объектов для получения продуктов метаболизма.

Синтетические среды - это среды определенного состава, пред­ставленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точно указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов. Обязательными компонентами таких сред являются неорганические соединения (соли) и углерод - и азотсодержащие вещества (типичными представителями являются глюкоза и (NH₄)₂SO₄. Часто к таким сре­дам добавляют буферные растворы и хелатирующие соединения. Ауксотрофные организмы растут на таких средах только при добавлении соответствующих факторов роста. Основное назначение таких пита­тельных сред - изучение особенностей физиологии и метаболизма микроорганизмов, выделение генетических рекомбинантов и т. д.

По назначению среды разделяют на элективные и дифференци­ально-диагностические. Элективные среды обеспечивают преиму­щественное развитие одного или целой физиологической группы мик­роорганизмов (например, среда Китт-Тароцци – для анаэробной микрофлоры, среда Петраньяни – для кислотоустойчивых микробов (возбудитель туберкулеза)). Элективными могут являться естественные среды накопления сенной и картофельной палочек. Например, для преимущественного выделения грамотрицательных бактерий бывает достаточным добавления в питатель­ную среду трифенилметановых красителей (кристаллический фиоле­товый, малахитовый зеленый и т. д.). Для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этой концентрации рост других бактерий подавляется.

Электив­ные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий, т. е. при получении накопительной культуры.

Дифференциально-диагностические среды применяются для быст­рой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности (т.е. для выращивания определенного вида микробов), в клинической бактериологии и др. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор фермен­тов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. Т.е. критерием для дифференциации служит способность различных видов микробов ферментировать те или другие углеводы и многоатомные спирты, содержащиеся в питательных средах. К таким средам относятся среды Гиса с индикатором, агар Эндо и др.

В состав дифференциально-диагностической среды входят:

а) основ­ная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий;

б) определенный химический субстрат, отношение к которому являет­ся диагностическим признаком для данного микроорганизма;

в) цвет­ной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о био­химической реакции и наличии данной ферментной системы у иссле­дуемого микроорганизма.

Например, среда Эндо позволяет отличить клоны, сбраживающие лактозу, от клонов, не обладающих этим свой­ством. Основными компонентами этой среды являются питательный (пептонный) агар, углевод и основной фуксин, обесцвеченный сульфи­том (реактив Шиффа). Исходная питательная среда окрашена в розо­вый цвет. Микроорганизмы, не сбраживающие лактозу, образуют бесцветные колонии. При сбраживании лактозы до ацетальдегида по­следний реагирует с сульфитом и развивается красная окраска соот­ветствующих колоний. Среда с эозином и метиленовым синим (среда Левина) в качестве индикаторов содержит эозин и метиленовый синий и исходно окрашена в черно-синий цвет. Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии, окрашенные в черный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие этим свойством, бесцветны. Подобные изменения окраски происходят потому, что красители при­сутствуют в среде не в виде самостоятельных соединений, а в виде комплексов с веществами питательной среды. При низких значениях рН эти комплексы выпадают в осадок, исходные же красители в этих условиях растворимы, при больших рН комплексы красителей бес­цветны, тогда как метиленовый синий приобретает синюю окраску. Данная среда позволяет дифференцировать бактерии рода Escherichia от бактерий рода Proteus.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: