Принцип действия кондуктометрического гемоцитометра

Гемоцитометры предназначены для определения содержания форменных элементов крови. К форменным элементам относятся эритроциты, лейкоциты и тромбоциты. Эритроциты имеют размеры Æ7,5´2 мкм, а лейкоциты более крупные и более бесформенны, чем эритроциты. Концентрация эритроцитов лежит в диапазоне (2…8)×10¹² 1/л, а концентрация лейкоцитов – в диапазоне (3…300)×10⁹ 1/л. Нижний предел диапазона концентрации эритроцитов соответствует анемии (малокровию), а верхний предел диапазона концентраций лейкоцитов соответствует острому лейкозу (белокровию). Норма эритроцитов – 5×10¹² 1/л, а норма лейкоцитов – 7×10⁹ 1/л.

Камера Горяева 1 притирается к простому стеклу 2 и с помощью пипеточного дозатора 3 в камеру вводится проба крови с разведением 1:200, которая по каналам растекается по всей поверхности камеры. Затем через микроскоп подсчитывают частицы в квадратах. При определении концентрации эритроцитов для простоты подсчитывают количество эритроцитов в квадратах, расположенных по диагонали, т.е. в 80 малых квадратах, и рассчитывают ее по формуле

1/мкл,

где N _Э – подсчитанное количество эритроцитов.

Для подсчета лейкоцитов нужно сперва гемолизировать (растворить) эритроциты. Для этого применяют 3% раствор уксусной кислоты, гипсофилин, сапонин и другие вещества. Метод Горяева весьма точен (при отсутствии субъективных ошибок) и применяется достаточно широко и сейчас. Однако он трудоемок и утомителен для зрения. Для механизации и автоматизации этого вида анализа были созданы кондуктометрические гемоцитометры. Изобретателем первого гемоцитометра является Культер (Франция), который затем основал фирму Coulter, выпускающую разнообразное медицинское оборудование, прежде всего для лабораторных анализов.

В основе работы кондуктометрического гемоцитометра лежит изменение сопротивления канала микроотверстия датчика при прохождении через него частицы (рис. 1.2). Датчик 1 представляет собой кювету (канюлю) с микроотверстием, выполненным в часовом камне 2. Диаметр микроотверстия 50 – 200 мкм. Датчик помещается в стакан 3 с пробой крови. Проба крови растворяется в физрастворе (0,9% NaCl), т. е. проба является проводящей жидкостью. Внутри и снаружи датчика располагаются электроды Э1, Э2. С помощью пневмосистемы проба втягивается в канюлю. Когда жидкость достигает электрода Э1, образуется электрическая цепь, через которую протекает стабильный ток I₀. При попадании в канал микроотверстия частицы изменяется (увеличивается) сопротивление канала и на зажимах датчика возникает импульс напряжения.

Оценим амплитуду импульса напряжения, получаемого на зажимах датчика. Для этого надо найти изменение сопротивления при попадании частицы в канал. Частица имеет проводимость намного меньшую проводимости раствора. Для простоты будем считать частицу кубической (a << d). Выделим слой раствора толщиной а (рис 1.3). Сопротивление слоя без частицы будет равно

где r - удельное сопротивление физраствора (156 Ом/см), S – сечение микроотверстия (). Сопротивление слоя при наличии в нем частицы будет равно

.

Тогда сопротивление получит приращение

,

где V – объем частицы.

Амплитуда импульса будет равна

. (1.1)

Ток питания датчика выбирают таким, чтобы не возникал электролиз физраствора – в пределах 0,2…0,4 мА. Примем ток датчика I₀ = 0,3 мА, диаметр микроотверстия d = 100 мкм, объем эритроцита V = 60 мкм³. Тогда по формуле (1.1) найдем

U_m = 0,45 мВ. Таким образом, сигнал на выходе датчика получается очень маленьким и требует значительного усиления. Размер лейкоцитов в 2 – 3 раза больше, чем эритроцитов, поэтому и сигнал, возникающий при их прохождении через канал, также больше.

Электрическое сопротивление датчика в основном определяется сопротивлением канала R _к = rl _к/ S и равно 20 – 30 кОм.

Для получения правильных результатов необходимо, чтобы частицы проходили через канал микроотверстия по одной, иначе показания будут заниженными: при одновременном прохождении по каналу двух и более частиц будет возникать один импульс. Поэтому проба крови сильно разводится. Оценим минимальный коэффициент разведения. Учитывая, что в канале должна находиться одна частица, концентрация разведения должна быть С _р = 1/ V _к, где V _к – объем канала: V _к = l _к× pd²/4. Приняв l _к = 0,3 мм; d = 100 мкм = 0,1 мм, получим V _к = 2,4×10^-9 л, С _р = 0,4×10⁹ 1/л. Тогда минимальный коэффициент разведения по эритроцитам будет равен N _рэ = С _эн/ С _эр = 5×10¹²/0,4×10⁹ = 12500. На практике, с учетом возможного склеивания частиц (коинциденции), коэффициент разведения по эритроцитам берут намного больше: 63000 – 125000. Коэффициент разведения по лейкоцитам берут равным 250 – 500.

Обычно пробоподготовку производят в двух пробирках (рис. 1.4): в одной из них 5 мл физраствора (ф/р), а во второй – 10 мл. В первую пробирку дозатором помещают пробу крови 20 мкл и получают разведение 1:250. Затем дозатором из первой пробирки набирают 20 мкл, помещают во вторую пробирку и получают разведение 1:125000. Таким образом, во второй пробирке получают разведенную пробу на эритроциты. Затем в первую пробирку добавляют 5 мл ф/р (можно из второй пробирки) и получают разведение 1:500. Для измерения концентрации лейкоцитов содержимым первой пробирки заправляют стакан и добавляют в него гемолитик (гипсофилин, сапонин и др.), растворяющий эритроциты.

Гемоцитометры бывают аналоговые и цифровые. Принцип работы аналоговых гемоцитометров основан на пропорциональной зависимости между частотой импульсов датчика и концентрацией частиц. В цифровых гемоцитометрах производится прямой подсчет частиц (импульсов, которые они вызывают).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: