Физические принципы

Метод фотоколориметрии является самым распространенным при проведении биохимических анализов. Он служит для определения концентрации вещества в растворах, которым специально подготовленная проба придает характерную окраску. Достоинством метода является быстрота выполнения анализа, возможность обнаружения одного вещества в присутствии других без их предварительного отделения, сравнительная простота колориметрической аппаратуры.

Физической основой метода колориметрии является закон Бугера-Ламберта-Бера. Его суть состоит в том, что слои вещества одинаковой толщины всегда поглощают одну и ту же часть падающего на них света. Пусть на поверхность некоторого слоя падает световой поток Ф₀ (рис. 2.1). В слое толщиной dx теряется часть светового потока, пропорциональная толщине и световому потоку:

Отсюда получаем дифференциальное уравнение

.

Решением этого уравнения будет . При х = 0 Ф = Ф ₀, С = ln Ф ₀ и окончательно находим

или .

На выходе слоя толщиной а имеем

или , (2.1)

где k – коэффициент поглощения.

Изучая поглощение света растворами, Бер установил, что коэффициент k пропорционален концентрации поглощающего вещества С:

k = e C, (2.2)

где e - молярная экстинкция (погашение). Объединяя (2.1) и (2.2), запишем

.

Величина

(2.3)

называется оптической плотностью раствора. Таким образом, оптическая плотность раствора пропорциональна его концентрации. Главной задачей фотоколориметрии и является, по существу, определение этого параметра. Кроме оптической плотности в фотоколориметрии используют также коэффициент пропускания t = Ф _t/ Ф ₀. Очевидно

. (2.4)

По принципу действия фотоколориметры бывают

- неэлектрические неавтоматизированные («ручные»);

- электрические неавтоматизированные;

- электрические полуавтоматические;

- электрические автоматические (биохимические автоматы).

Прибор имеет две кюветы: одну – прямоугольную, а вторую – клиновидную. В прямоугольную кювету заливается исследуемый раствор, а в клиновидную – с известной концентрацией (стандартный). Дневной свет, проходя через матовое стекло и кюветы, а затем через призму, попадает в объектив. Наблюдатель видит в нем две половины поля с разной интенсивностью окраски. Изменяя с помощью ручки положение по высоте клиновидной кюветы, добиваются одинаковой интенсивности окраски обеих половин. Концентрация исследуемого раствора определяется по формуле

.

Вместо стандартных растворов могут использоваться цветные желатиновые клинья. Погрешность колориметров обусловлена, прежде всего, субъективной оценкой интенсивности окраски раствора. В настоящее время практически повсеместно применяются фотоэлектрические колориметры (ФЭК).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: