Лабораторна робота № 20 Кількісне визначення вмісту білків за нінгідриновим методом

Необхідні прилади і реактиви:

1.Фотоколориметр і кювети;

2.Мірні колби місткістю 25мл - 2 шт.;

3.Стандартний розчин гліцину, що містить 50мг гліцину у 1 мл;

4. 0,1% р-н нінгідрину в 95% ацетоні.

Принцип методу. В результаті взаємодії α-амінокислот з нінгідрином (трикетогідрінденом) утворюється забарвлена комплексна сполука. При нагріванні до 70○С α-амінокислоти окислюються нінгідрином та вступають в реакції окисного дезамінування з утворенням аміаку, диоксиду вуглецю та альдегіду, а нінгідрин відновлюється.

Відновлений нінгідрин, конденсується з аміаком та окисненим нінгідрином, утворюючи єнольну сполуку, що має синьо-фіолетове забарвлення.

В присутності органічних розчинників (ацетон, етиловий спирт) можливе протікання побічного процесу з утворенням сполуки, що має в своєму складі радикал амінокислоти, і забарвлена вона у червоний, жовтий, голубий колір. Гліцин з нінгідрином має синьо-фіолетове забарвлення.

Хід роботи. В одну колбу на 25 мл вносять 20 розчину гліцину з концентрацією 50 мг/мл, доводять до мітки дистильованою водою, отримують стандартний розчин порівняння. В другу колбу вносять досліджуваний розчин з невідомим вмістом гліцину. В обидві колби додають по 10-15 крапель розчину нінгідрину, перемішують, нагрівають на протязі 5 хвилин при 70⁰С, охолоджують доводять до риски дистильованою водою і через 30 хв спостерігають екстинкцію за допомогою фотоколориметру у кюветі з товщиною 10 мм при червоному світлофільтрі (750 нм). Як розчин порівняння використовують дистильовану воду. Потім проводять визначення оптичної густини в задачі. Знаходять невідому концентрацію гліцину в задачі за формулою:

Контрольні питання.

1. Принцип методу кількісного визначення вмісту білків за нінгідриновим методом.

2. Які побічні реакції можуть протікати в присутності органічних розчинників при фотометричному визначенні амінокислот за нінгідриновим методом?

3. Які фактори впливають на величину молярного коефіцієнта поглинання при визначенні гліцину за нінгідриновим методом?

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: