Процесс периодического культивирования дрожжей в лабораторном ферментаторе

В подготовленный для культивирования ферментатор (рис. 14) со стерильной питательной средой в стерильных условиях вносят 10 % (об.) инокулята (см. тему 1). В случае использования в качестве посевного материала лиофильно высушенных дрожжей их необходимо предварительно развести в стерильной воде и добавить в ферментатор из расчета 4 г сухих дрожжей на литр питательной среды.

Культивирование дрожжей ведут при следующих условиях:

- температура культивирования – 28-30 °С;

- частота вращения мешалки – 200 об/мин;

- время культивирования – от 12 до 24 часов.

Рисунок 14 – Лабораторный

ферментатор

Анализ процесса культивирования по результатам микроскопирования дрожжей

Регулярное микроскопическое наблюдение за клетками дрожжей дает возможность оценить их морфологическое и физиолого-биохимическое состояние, степень чистоты дрожжевой культуры. При микроскопировании характеризуют морфологию дрожжей (их форму, размер), количество почкующихся клеток и характер почкования, количество отмерших клеток, наличие и количество посторонних дрожжей и бактериальных клеток.

Определение количества (доли) мертвых дрожжевых клеток

Каплю суспензии дрожжей, нанесенную на предметное стекло, смешивают с каплей раствора метиленового синего. Через две минуты пробой полученной смеси заполняют счетную камеру и подсчитывают общее количество дрожжевых клеток, затем количество только мертвых (окрашенных в синий цвет) клеток.

Определение гликогена в дрожжевых клетках по методу Селищенской

В пробирку отбирают 1 мл пробы дрожжевой суспензии и 0,1 мл 1 н раствора серной кислоты. Через 10 минут добавляют 0,1 мл 0,5 % раствора йода. Через 2-3 минуты готовят препарат «раздавленная капля». Цитоплазма дрожжевых клеток окрашивается в светло-желтый цвет, гранулы гликогена – в красно-бурый цвет раствора йода.

В нормально развивающихся дрожжевых клетках гликоген занимает от 1/3 до 2/3 объема клетки (рис. 15). Если гликогена меньше 1/4 объема клетки, его содержание считается недостаточным. Молодые дрожжи окрашиваются йодом в светло-желтый цвет. В зрелых, старых или голодных клетках гликоген отсутствует или содержится в незначительных количествах в вакуолях.

Рисунок 15 – Дрожжи

Saccharomyces cerevisiae в

различном возрасте:

а – молодые клетки;

б – зрелые клетки;

в – старые клетки.

Определение морфологического состояния клеток

Дрожжи должны иметь форму и размеры, характерные для используемой расы.

Молодые клетки должны быть одной величины, с тонкой оболочкой, однородной или мелкозернистой цитоплазмой, небольшими вакуолями. Наличие большого количества морфологически измененных клеток свидетельствует о дегенерации культуры. Зернистая цитоплазма, крупные вакуоли и отсутствие почкующихся клеток характеризует старую культуру.

Определение чистоты дрожжевой культуры

На предметное стекло наносят каплю 10 % раствора едкого кали и смешивают ее с каплей дрожжевой суспензии. Готовят препарат «раздавленная капля». Микроскопируют препарат и просматривают несколько полей зрения, отмечая наличие диких дрожжей (отличающихся по форме клеток) и бактерий (палочковидные, кокки).

Биологически чистой признается культура дрожжей-продуцентов, содержащая не более 1 % бактерий и 0,5 % диких дрожжей. Если количество посторонней микрофлоры значительно превышает эти нормы, то степень зараженности посторонней микрофлорой определяют посевом суспензии дрожжей на несколько элективных питательных сред для выявления количества клеток посторонних микроорганизмов и распределения их по группам.

Подсчет числа клеток микроорганизмов в камере Горяева-Тома

Счетная камера Горяева-Тома представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками на площадки. Центральная часть стекла ниже боковых на 0,1 мм, и на каждой ее площадке нанесена сетка. Площадь большого квадрата сетки равна 1/25 мм², площадь малого – 1/400 мм². Каплю исследуемой суспензии наносят на сетку, накрывают шлифованным покровным стеклом и притирают покровное стекло к боковым площадкам камеры путем смещения его в противоположные стороны (до появления радужных пятен на боковых площадках стекла). Можно также сначала притереть покровное стекло, а потом осторожно заполнить камеру из пипетки.

Подсчет числа клеток проводят с объективом 8 ´ или 40 ´. Для получения достоверных результатов подсчет следует проводить в 8-10 больших или в 20 малых квадратах сетки и в трех препаратах. При подсчете учитывают все дрожжевые клетки лежащие в квадрате сетки, а также клетки дрожжей пересекающие верхнюю и правую сторону квадрата. При подсчете число клеток микроорганизмов в больших квадратах не должно превышать 20, а в малых – 10. В противном случае исходную дрожжевую суспензию разводят водопроводной водой.

Подсчет числа клеток рекомендуется начинать не раньше, чем через 3-5 минут после заполнения камеры, чтобы клетки осели и были видны в одной плоскости. Число клеток в 1 мл исходной суспензии вычисляют по формуле:

М = а · 1000 · n / h · S, (3.1)

где М – число клеток в 1 мл суспензии;

а – среднее число клеток в квадрате сетки;

h – глубина камеры (0,1 мм);

S – площадь квадрата сетки в мм²;

n – коэффициент разведения исследуемой суспензии.

Зная значения оптической плотности проб микробных суспензий, отобранных для подсчета числа клеток, можно построить калибровочный график D=f (М). В случае применения данной культуры в дальнейших экспериментах можно, измеряя содержание оптической плотности проб микробной суспензии и пользуясь калибровочным графиком, определять число клеток дрожжей (млн./мл) в отобранных пробах.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: