Спиртовое брожение. Механизм анаэробного процесса и технологические особенности

Этиловый спирт – широко распространенный продукт обмена веществ у микроорганизмов. Даже растения и многие грибы в анаэробных условиях накапливают этиловый спирт. Основными промышленными продуцентами этанола являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые также используются в пивоварении, хлебопекарной и винодельческой промышленности. Дрожжи относятся к эукариотам и обладают полностью сформированным аппаратом дыхания, однако, являясь факультативными аэробами, в отсутствии кислорода они осуществляют процесс брожения.

Спиртовые дрожжи, в частности, Sacch. сerevisiae раса XII в процессе спиртового брожения накапливают до 10-11 % этанола в культуральной жидкости.

Чрезвычайно перспективны в качестве промышленных продуцентов бактерии р. Zymomonas: Z. mobilis, Z. аnaerobia, поскольку они менее чувствительны к накапливаемому этанолу. Вследствие этого они сохраняют собственную жизнеспособность при концентрации этанола до 14 %. Кроме того, бактерии отличаются скоростью потребления глюкозы и образования этанола в 2-3 раза большей, чем у дрожжей (метаболический коэффициент = 1,87 г/г · ч).

Основным субстратом для биосинтеза этанола выступают моно- и дисахариды – гексозы, полученные путем гидролиза и осахаривания крахмалистого сырья (см. тему 1) и относимые к сбраживаемым сахарам.

Спиртовое брожение протекает в несколько стадий.

Начальная стадия называется дрожжегенерацией: до тех пор, пока в среде достаточно растворенного кислорода, дрожжи интенсивно размножаются. Процесс роста биомассы сопровождается интенсивным окислением гексоз до углекислого газа и воды с высоким энергетическим выходом:

C₆H₁₂О₆ + 1/2О₂ + 38АДФ + 38Ф_н → 6СО₂ + 38АТФ + 6Н₂О

С исчерпанием в среде кислорода дыхание ослабевает и начинается стадия интенсивного брожения с образованием в качестве основного продукта этанола. Скорость размножения клеток и прирост биомассы при этом значительно снижаются.

На последней стадии, когда исчерпываются сбраживаемые сахара – гексозы, дрожжи используют полисахарид – гликоген, запасенный в клетках на стадии дрожжегенерации.

Процесс брожения протекает последовательно в два этапа.

Первый этап – общий для процесса дыхания и для брожения, называется гликолизом. В ходе гликолиза происходит окисление глюкозы до пировидоградной кислоты (ПВК) с образованием двух молекул АТФ и двух молекул восстановительных эквивалентов (НАДН+Н⁺).

C₆H₁₂О₆ + 2АДФ + 2Ф_н + 2НАД⁺ → 2ПВК + 2АТФ + 2(НАДН + Н⁺) + 2Н₂О

На втором этапе происходит ферментативное превращение ПВК с образованием различных акцепторов электронов (атомов водорода) в зависимости от типа брожения и природы продуцентов.

В случае спиртового брожения под действием фермента пируваткарбоксилазы ПВК превращается в уксусный альдегид, который затем выступает в качестве акцептора атомов водородов, с сопряженным получением окисленных форм восстановительного эквивалента (НАД⁺). Реакция катализируется ферментом алкогольдегидрогеназой:

СООН СО₂ Н НАДН + Н⁺ НАД⁺ Н

С = О С = О Н–С–ОН

СН₃ ^{пируваткарбоксилаза} СН₃ ^{алкогольдегидрогеназа} СН₃

Суммарное уравнение спиртового брожения имеет вид:

C₆H₁₂О₆ + 2АДФ + 2Ф_н → 2С₂Н₅ОН + 2СО₂ + 2АТФ + Н₂О

Количество АТФ, требуемое для биосинтеза микробной массы, одинаково вне зависимости от того, растут ли клетки в аэробных или анаэробных условиях, поэтому на стадии брожения для биосинтеза эквивалентного количества клеточного материала дрожжам необходимо утилизировать значительно больше глюкозы. Поскольку в ходе превращения 1 молекулы глюкозы в этанол путем брожения образуются лишь 2 молекулы АТФ против 38 в процессе дыхания, брожение является менее энергетически эффективным процессом.

На рисунке 11 представлена кривая брожения, характеризующая сбраживание сахаров в среднем за каждый час от начала брожения (в % от начального количества сахаров).

Рисунок 11 – Кривая брожения

Кривая получена для минимального количества инокулята (суспензии накопленных дрожжей для внесения в подготовленное сусло), который был отобран из суспензионной культуры дрожжей ушком платиновой проволоки и внесен в 200 мл сусла. Поэтому на кривой брожения можно отчетливо выделить три периода брожения: взбраживание, главное брожение и дображивание.

В первый период, продолжающийся приблизительно 60 часов (взбраживание), происходит медленное накопление дрожжевой массы, количество сброженных сахаров очень мало. Во второй период (60-120 часов) размножение дрожжей и сбраживание сахаров за каждый час резко усиливаются, достигая максимума (главное брожение). В третий период кривая брожения выходит на плато, асимптотически приближаясь к оси абсцисс (дображивание). Общее время процесса брожения в условиях лабораторного исследовательского эксперимента оказалось весьма длительным.

В условиях промышленной реализации спиртового брожения период взбраживания не так заметен на кривой брожения, так как стадия дрожжегенерации вынесена в другой аппарат (дрожжегенератор), и засевные дрожжи вносятся во взбраживатели в значительно большем количестве. Например, при сбраживании крахмалистых заторов периодическим способом количество засевных зрелых дрожжей содержанием 100-120 млн. клеток в 1 мл составляет 5‑8 % объема бродильного чана и вносится единовременно.

В период главного брожения сбраживается основная масса сахара. В условиях нормально протекающего процесса количество сбраживаемых сахаров (отброд) уменьшается в среднем на 1 % в час.

Наличие длительной стадии дображивания характерно для заторов из крахмалистого сырья и обусловлено крупностью частиц и, соответственно, плохой растворимостью части полисахаридов субстрата и их недоступностью для ферментов. В заторах, полученных осахариванием разваренной массы ферментами солода, из всего крахмала, принятого за 100 %, около 4-6 % находится в виде нерастворенного крахмала, около 75-77 % – превращенного в мальтозу и около 19 % – превращенного в декстрины (эти цифры получены для конкретного помола и могут быть улучшены за счет тонкого измельчения). Крахмал и декстрины могут быть сброжены дрожжами лишь после осахаривания до мальтозы, которое осуществляется α- и β-амилазами и изоамилазой. Осахаривание, особенно нерастворенного крахмала, происходит медленно и неполностью. Скорость дображивания не зависит от количества дрожжей, а определяется, главным образом, содержанием α-глюкозидазы и изоамилазы.

В реальном технологическом процессе брожение проходит с большим количеством засевных дрожжей значительно интенсивней и практически без периода взбраживания. Общая продолжительность брожения (главного брожения и дображивания) при начальной концентрации редуцирующих сахаров 15-18 % составляет составляет 48-72 часа в зависимости от способа организации процесса брожения (периодический, проточный и др.).

Кроме биомассы в культуральной жидкости по окончании процесса спиртового брожения (бражке) присутствуют остаточный субстрат, от 8 до 11 % этанола, а также побочные продукты метаболизма – «сивушные масла», более всего спирты: изоамиловый (62 % от количества примесей), пропиловый (12 %) и изобутиловый (15 %).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: