Визначення калію і натрію в біологічних рідинах методом полум’яної фотометрії

Мета роботи: вивчити особливості обміну води і мінеральних речовин в організмі, засвоїти методики визначення натрію і калію в біологічних рідинах.

Питання для самопідготовки:

1. Водяні сектори.

2. Основні макро- і мікроелементи.

3. Обмін води.

4. Обмін мінеральних речовин.

5. Взаємозв'язок обміну води та мінеральних речовин.

ТЕОРЕТИЧНА ЧАСТИНА

Біологічна роль води

Вода – найпоширеніша сполука в живих організмах. Вона становить близько 75 % біомаси Землі. В організмі людини вміст води залежить від віку. Так, у чотиримісячних ембріонів міститься 94 % води, у новонароджених – 70-75 %, у дорослої людини – близько 65 %, а у старечому віці її вміст знижується до 45 %. У різних органах і тканинах дорослої людини вміст води нерівномірний і становить 70-85 %. Винятком є кісткова і жирова тканини, які містять менше 30 % води, та біологічні рідини (плазма крові, лімфа, ліквор, травні соки, сеча, сльози тощо) – більше 90 %. Отже, вода є основним середовищем для перебігу життєво важливих фізико-хімічних і біохімічних процесів.

Важливі й різноманітні функції води в живих організмах зумовлені дипольною природою молекул води. У рідкому стані вода складається із скупчень (кластерів) молекул, зв'язаних одна з одною водневими зв'язками. Поодинокий водневий зв'язок – це досить слабкий зв'язок, але завдяки своїй численності вони визначають унікальні фізичні й хімічні властивості води, які, у свою чергу, використані живими організмами для реалізації деяких процесів життєдіяльності. Так, висока теплота випаровування води (0,54 ккал/г) забезпечує один із механізмів терморегуляції – тепловіддачу шляхом випаровування поту. А висока теплоємність води дозволяє організму підтримувати відносно постійну температуру тіла при значних коливаннях температури повітря.

Висока діелектрична стала полярних молекул води і сильно виражена здатність їх утворювати водневі зв'язки роблять воду універсальним розчинником. Навколо розчинених частинок іонів і молекул утворюється гідратна оболонка. Гідратація біомолекул забезпечує разом з іншими факторами їх просторову структуру. Білки, фосфоліпіди, нуклеїнові кислоти утворюють у водних розчинах структури, в яких гідрофобні неполярні групи ізольовані від водної фази, а на поверхні знаходяться гідрофільні групи, що взаємодіють із молекулами води. З цим і пов'язана просторова організація надмолекулярних структур, зокрема ліпопротеїнових міцел, мембран, клітинних органел. Таким чином, вода забезпечує структуру білків, нуклеїнових кислот, ліпопротеїнів та надмолекулярних міцел (мембран і органел). При значному відхиленні вмісту води у тканинах від норми порушується функціонування органел, зокрема процес окислювального фосфорилювання в мітохондріях, синтез білків на рибосомах. Завдяки гідратації іонів і молекул частина води в організмі знаходиться у зв'язаному стані. Гідратна (імобільна) вода не проявляє властивостей розчинника.

Вода як розчинник забезпечує транспорт речовин в організмі, дисоціацію і, тим самим, активацію ряду біомолекул, є середовищем для перебігу більшості ферментативних реакцій. Крім того, вода безпосередньо служить субстратом в реакціях гідролізу і гідратації, утворюється в процесі тканинного дихання при окисненні вуглеводів, жирів чи амінокислот. Цю воду називають ендогенною або метаболічною. При повному окисненні до кінцевих продуктів 100 г вуглеводів вивільняється 55,6 мл води, 100 г білків – 41,3 мл, а 100 г жирів – 107,1 мл. За добу в організмі людини утворюється 300-400 мл ендогенної води.

Вода, що надходить в організм з продуктами харчування (з першими і другими стравами, напоями), складає так звану екзогенну воду. Потреба в екзогенній воді для дорослої людини становить в середньому 40 г/кг маси тіла. Дітям її потрібно в 3 рази більше. Всмоктування екзогенної води відбувається в тонкому кишечнику. Звідси вона потрапляє через ворітну вену в печінку. Частина її тут затримується, а решта кров'ю розноситься до різних органів і тканин. Частина води надходить у кишечник із травними соками, значна кількість її зворотно абсорбується в товстих кишках. Між кров'ю, органами і тканинами існує постійний динамічний обмін водою. Вміст води в тканинах знаходиться у прямій залежності від рівня інтенсивності обміну речовин. Залежно від різниці між кількістю води, що надходить, і кількістю виділеної води, розрізня­ють позитивний, негативний і нульовий баланс води.

Розподіл води та електролітів в організмі

Близько 2/3 води в організмі людини знаходиться всередині клітин, а 1/3 – позаклітинна вода, яка, в свою чергу, поділяється на міжклітинну (інтерстиціальну) рідину (25 % всієї воду) та води плазми крові і спеціалізованих позаклітинних рідин (рис. 6). Вода вільно проходить через клітинні мембрани і розподіл її між клітинами та міжклітинним простором визначається осмотичними та гідростатичними силами.

За електролітним складом, внутрішньо- і позаклітинні рідини організму значно відрізняються (табл. 9).

Головним катіоном плазми крові і міжклітинної рідини є Na⁺, а внутрішньоклітинна концентрація його приблизно у 15 раз менша. Концентрація К⁺ всередині клітини в 30-40 разів більша, ніж у позаклітинній рідині. Рівень Mg²⁺ приблизно у 15 раз вищий у внутрішньоклітинній рідині. Концентрація іонів Са²⁺ в цитоплазмі клітин у стані спокою дорівнює тільки 10^-7 моль/л, тобто на декілька порядків менша, ніж у позаклітинній рідині. Для того, щоб підтримувати ці градієнти концентрації іонів, затрачається велика кількість енергії.

Рис. 6. Розподіл води в організмі.

У плазматичній мембрані більшості клітин знаходяться транспортні АТФази, які за рахунок енергії гідролізу АТФ переносять катіони проти градієнта концентрації. Серед аніонів у позаклітинній рідині переважають хлориди і гідрокарбонати, а всередині клітини – фосфати і білки. Електронейтральність середовищ забезпечується рівністю сумарних кількостей катіонів і аніонів.

Таблиця 9

Електролітний склад рідин організму людини

Електролітний (іонний) склад, рН і осмотичний тиск є основними параметрами рідин організму, які підтримуються постійними за допомогою регуляторних механізмів, а при їх відхиленні за межі фізіологічної норми розвиваються патологічні зміни в організмі.

Регуляція водно-сольового обміну

Вода і солі надходять в організм із їжею і напоями. Незважаючи на значні щоденні коливання надходження, в нормі об'єм рідини і концентрація електролітів (Na⁺, К⁺, Cl^-, Са²⁺, Mg²⁺) утримуються у сталих межах. Підтримка водно-сольового гомеостазу залежить від рівноваги між надходженням і виділенням. У звичайних умовах здорова доросла людина втрачає за добу близько 1,5 л води із сечею, 100-200 мл – із фекаліями, 250-500 мл – через легені, 300-500 мл – з потом. Виведення перевищує надходження на величину ендогенного утворення води (0,3-0,4 л). Із звичайним раціоном потрапляє 100-200 ммоль натрію і хлориду, 80-120 ммоль калію і стільки ж виділяється, головним чином, із сечею (табл. 10).

Таблиця 10

Добовий кругообіг води і електролітів у тілі людини

Основну роль у забезпеченні балансу води й електролітів відіграє регуляція виведення їх через нирки, яку здійснюють гормони вазопресин, альдостерон і натрійуретичний гормон передсердь. Вазопресин (інакше антидіуретичний гормон) виділяється при підвищенні осмотичного тиску позаклітинної рідини і збільшує швидкість реабсорбції води у дистальних звивистих канальцях нефрону. Виділяється висококонцентрована сеча. Крім того, градієнт осмотичного тиску на мембрані клітин гіпоталамічного центру зумовлює відчуття спраги і збільшення споживання води. У результаті відновлюється нормальна осмолярність позаклітинної рідини.

При зниженій осмолярності позаклітинної рідини альдостерон стимулює реабсорбцію іонів натрію епітеліальними клітинами дистальних відділів нефрону в обмін на іони калію чи водню. Альдостерон також викликає затримку Na⁺ і втрату К⁺ у слинних і потових залозах, слизовій оболонці дистальних відділів товстої кишки. Синтез і секреція альдостерону корою надниркових залоз регулюється рядом факторів. Основною є ренін-ангіотензинова система, яка реагує на об'єм циркулюючої крові. Знижений нирковий кровообіг запускає секрецію нирками реніну, що призводить до утворення ангіотензину II, який, у свою чергу, стимулює секрецію альдостерону і звуження судин. Затримка натрію сприяє затримці води і зростанню об'єму циркулюючої крові.

Гальмує реабсорбцію натрію у ниркових канальцях натрійуретичний гормон передсердь, який утворюється і секретується в кров у відповідь на збільшення об'єму плазми крові, підвищення артеріального тиску. Внаслідок підвищеного виділення з організму натрію і води об'єм циркулюючої крові зменшується, артеріальний тиск знижується.

Якщо порушується нормальне функціонування гомеостатичних механізмів, виникають клінічні прояви змін осмотичного тиску і об'єму рідини в організмі.

Порушення обміну води і натрію

Порушення водного обміну викликають зміни якісного і кількісного співвідношення внутрішньоклітинного і позаклітинного водного середовища організму. Зміни обміну води тісно пов'язані з порушеннями електролітного обміну, зокрема натрію і хлору. У випадку затримки води в організмі або переважання надходження її над виведенням має місце позитивний водний баланс. Він супроводжується гідратацією тканин. Підвищення виділення води з організму (негативний водний баланс) викликає дегідратацію тканин, зневоднення організму. Як гіпергідратація, так і дегідратація можуть бути позаклітинні, внутрішньоклітинні й змішані.

Мінеральні речовини

Крім органічних речовин (білки, вуглеводи, нуклеїнові кислоти тощо), до складу тіла тварин і людини входять і неорганічні речовини. З усіх неорганічних речовин в організмі людини найбільше знаходиться води (65 %). Усі решта мінеральні речовини складають 5-6 % маси тіла. Частина мінеральних речовин знаходиться в розчинному стані у біологічних рідинах (електроліти) і відповідає за підтримку гомеостазу внутрішнього середовища. Інші утворюють сполуки з біомакромолекулярними та низькомолекулярними речовинами і в їх складі беруть участь у здійсненні різноманітних функцій клітин і тканин.

В організмі людини і тварин відкрито понад 75 хімічних елементів. Шість із них – вуглець, водень, азот, кисень, фосфор і сірка – входять до складу вуглеводів, ліпідів, білків, нуклеїнових кислот. Ці елементи називають органогенними.

Серед неорганічних елементів близько 20 є життєво необхідними (есенціальними) для людини, оскільки при їх дефіциті внаслідок неадекватності харчування чи надмірних втрат розвиваються захворювання. Неорганічні елементи поділяють на 2 групи: макроелементи і мікроелементи. Щоденна потреба в макроелементах перевищує 100 мг/добу, а для мікроелементів складає декілька міліграмів або мікрограмів. До макроелементів належать: натрій, калій, кальцій, магній, хлор. Основна маса їх в організмі знаходиться в тканинах у формі іонів та мінеральних солей. Частина фосфору також знаходиться у вигляді мінеральних солей. Вміст макроелементів в організмі вищий ніж 0,01 % від маси тіла.

Біологічна роль натрію і калію

Біологічні функції натрію і калію тісно взаємопов'язані. Наявність градієнтів концентрації їх між клітиною і міжклітинним простором зумовлює поляризацію мембран клітин (мембранний потенціал спокою) і виникнення під час збудження потенціалу дії. Таким чином, іони Na⁺ i K⁺ відповідають за проведення нервових імпульсів, скорочення м'язів. У тканинах, які не здатні збуджуватись та проводити імпульси, електрохімічні градієнти Na⁺ i K⁺ використовуються для регуляції об'єму клітин, для вторинного активного транспорту інших іонів, глюкози, амінокислот.

Обидва катіони відіграють важливу роль в осморегуляції, розподілі води в організмі, у складі буферних систем беруть участь в регуляції кислотно-лужної рівноваги.

Іони К⁺ активують всередині клітин значну кількість ферментів. В основному це ферменти, які каталізують реакції переносу фосфорних груп (кінази), реакції гідролізу (фосфатази) тощо. Показано, що іон К⁺, приєднуючись до алостеричного центру ферментів, стабілізує їх активну конформацію. У деяких випадках іон К⁺ зв'язується з активним центром ферментів і сприяє утворенню каталітично активної форми фермент-субстратного комплексу.

У процесі життєдіяльності клітин, при переході із стану спокою до поділу і під час клітинного циклу спостерігаються істотні зміни внутрішньоклітинного вмісту іонів Na⁺ i K⁺. Імовірно, що зміна співвідношень Na⁺/K⁺ відіграє важливу роль у регуляції процесів синтезу ДНК, РНК і білків на певних стадіях клітинного циклу.

Вміст натрію і калію в організмі дорослої людини складає 3000-4000 ммоль. Щоденно в організм надходить із їжею 2-4 г калію і до 5 г натрію. Цієї кількості достатньо для покриття потреби у даних елементах. Багато людей споживає значно більше натрію в складі кухонної солі, що сприяє розвиткові гіпертонії. Регуляція і порушення обміну натрію розглянуті вище.

Обмін калію. Від загальної кількості калію, що є в організмі людини, тільки до 2 % знаходиться у позаклітинній рідині. Завдяки великим резервам іонів калію у клітинах концентрація його в плазмі крові, на відміну від вмісту іонів натрію, лише деякою мірою залежить від змін водного балансу. Понад 85 % калію виводиться із сечею, решта – з калом. Тому підтримання кількості калію в організмі людини залежить від регуляції виділення його нирками. Із первинної сечі переважна частина калію реабсорбується у проксимальному відділі ниркових канальців і петлі Генлі, а в дистальному відділі канальців К⁺ секретується в обмін на іони Na⁺. Саме останній процес контролюється альдостероном. Нирковий механізм регуляції ефективно попереджує гіперкаліємію, проте менш ефективний в умовах гіпокаліємії. Так, при надмірному надходженні К⁺ в організм чи вивільненні із клітини внаслідок ушкодження тканин кора надниркових залоз викидає альдостерон і екскреція калію із сечею швидко зростає, забезпечуючи рівновагу. Коли ж надходження калію недостатнє, виділення його нирками поступово знижується до 10-20 ммоль на добу, але ця незначна втрата разом зі щоденним виведенням 8-10 ммоль/л калію через кишечник поступово призводить до виснаження резервів його в організмі і гіпокаліємії.

Підвищене виведення К⁺ з сечею може спостерігатись при деяких ниркових хворобах, гіперальдостеронізмі, метаболічному ацидозі, алкалозі, дії деяких медикаментів. Частою причиною гіпокаліємії є надмірна втрата через ШКТ (при блюванні, діареї, норицях). Дефіцит калію в організмі зумовлює зміни трансмембранного потенціалу клітин і проявляється загальною м'язовою слабкістю, аритміями, апатією, ослабленням сухожильних рефлексів. Подібні клінічні ознаки розвиваються і при гіперкаліємії, причинами якої є вивільнення К⁺ із клітин при ушкодженні тканин і порушення виділення його із сечею. При різко вираженій гіперкаліємії (понад 7,5-10 ммоль/л) настає зупинка серця. Як гіперкаліємія, так і гіпокаліємія викликають типові зміни ЕКГ.

ПРАКТИЧНА ЧАСТИНА

Практичне значення роботи: визначення натрію і калію методами полум’яної фотометрії дає змогу оцінити водний баланс в організмі, адже їх біологічна роль міститься в підтримці осмотичного тиску, кислотно-основного стану, оскільки вони входять до складу буферних систем крові.

1. Визначення калію в біологічних рідинах методом полум’яної фотометрії

Матеріали і реактиви: основні калібрувальні розчини для визначення калію в плазмі (сироватці), спинномозковій рідині, ексудатах, транссудатах, шлунковому вмісті, еритроцитах; гепарин (антикоагулянт).

Устаткування: полум’яний фотометр; компресор; балони з пропаном або іншим газом.

Принцип методу: розпилену у повітрі біологічну рідину вводять в газову суміш з високою температурою, що горить. В цих умовах багато елементів мають характерні для них спектри випускання. Концентрація досліджуваного електроліту пропорціональна інтенсивності відповідної ділянки спектру випускання полум’я, що реєструється приладом.

Хід роботи:

Підготовка матеріалу до визначення.

Плазма або сироватка. Кров центрифугують впродовж 15 хвилин при 3000 об/хв. Плазму (сироватку) обережно відсмоктують і розводять дистильованою водою 1:10. Відокремити плазму (сироватку) від еритроцитів слід не пізніше ніж через 1 годину після взяття крові.

Спинномозкову рідину, ексудат, транссудат розводять дистильованою водою 1:10.

Шлунковий вміст заздалегідь розводять дистильованою водою 1:50, а потім здійснюють розведення дистильованою водою 1:10.

Еритроцити. Гепаринізовану кров центрифугують впродовж 30 хвилин при 3000 об/хв. Потім плазму з верхнім шаром еритроцитів відсмоктують. Еритроцити набирають піпеткою з нижньої частини пробірки, гемолізують дистильованою водою, тобто розводять дистильованою водою у співвідношенні 1:260.

Сеча. Збирають добову сечу, вимірюють її кількість. Невелику кількість сечі центрифугують, розводять дистильованою водою 1:200.

При ввімкненні приладу спочатку пропускають стиснуте повітря, потом пропан. В бюкси діаметром 10-15 мм вносять відповідним чином приготовлену біологічну рідину і робочі калібрувальні розчини. Дослідження починають з налаштування приладу. Для цього калібрувальні робочі розчини вводять в газову суміш полум’яного фотометра, що горить, і налаштовують показання гальванометра (цифрового індикатора) у відповідності з калібрувальним графіком. Потім розпилюють розчини досліджуваних біологічних рідин. До і після кожного визначення розпилюють дистильовану воду для видалення слідів іонів. В ході визначення декілька разів перевіряють роботу приладу за допомогою одного з калібрувальних розчинів. Після закінчення досліджень прилад промивають впродовж 20 хвилин дистильованою водою.

Розрахунок здійснюють за калібрувальним графіком.

Побудова калібрувального графіку. З основних калібрувальних розчинів готують робочі розчини, як вказано в таблицях.

Таблиця 11

Робочі калібрувальні розчини для визначення калію в плазмі (сироватці) спинномозковій рідині, транссудаті ексудаті, шлунковому вмісті

Таблиця 12

Робочі калібрувальні розчини для визначення калію в еритроцитах

Таблиця 13

Робочі калібрувальні розчини для визначення калію в сечі

Робочі калібрувальні розчини оброблюють як дослідні проби і за отриманими даними будують калібрувальний графік.

Нормальні величини. Вміст калію: плазма – 3,44-5,3 ммоль/л; еритроцити – 77,8-95,7 ммоль/л; сеча – 80-100 ммоль/л; шлунковий вміст – 5,6-35,3 ммоль/л.

Відтворюваність. Коефіцієнт варіації 2%, допустима погрішність визначення 0,5 ммоль/л.

2. Визначення натрію в біологічних рідинах методом полум’яної фотометрії

Матеріали і реактиви: ті ж.

Устаткування: те ж.

Принцип методу: той же.

Хід роботи:

Підготовка матеріалу до визначення здійснюється так же, як при визначенні калію, за винятком того, що сироватку розводять 1:100, а еритроцити гемолізують дистильованою водою у співвідношенні 1:26. Хід визначення той же, що і при визначенні в біологічних рідинах калію.

Розрахунок здійснюється за калібрувальним графіком.

Побудова калібрувального графіку. З основних калібрувальних розчинів готують робочі розчини, як вказано в таблицях.

Таблиця 14

Робочі калібрувальні розчини для визначення натрію в плазмі (сироватці), спинномозковій рідині, транссудаті, ексудаті, шлунковому вмісті

Таблиця 15

Робочі калібрувальні розчини для визначення натрію в еритроцитах

Таблиця 16

Робочі калібрувальні розчини для визначення натрію в сечі

Робочі калібрувальні розчини обробляють як дослідні проби і за отриманими даними будують калібрувальний графік.

Нормальні величини. Вміст натрію: плазма – 130,5-156,6 ммоль/л; еритроцити – 13,48-21,75 ммоль/л; сеча – 320-340 ммоль/л; шлунковий вміст – 31,3-189,3 ммоль/л.

Відтворюваність. Коефіцієнт варіації 2%, допустима погрішність визначення 4 ммоль/л.

Зробити висновки.

Контрольні питання:

1. Біологічна роль води

2. Розподіл води та електролітів в організмі

3. Регуляція водно-сольового обміну

4. Порушення обміну води і натрію

5. Мінеральні речовини

6. Біологічна роль натрію і калію

7. Обмін калію

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ № 12

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: