Визначення сечовини в сироватці крові

Мета роботи: розглянути загальні закономірності катаболізму і анаболізму білків, розглянути сечовину як продукт обміну білків.

Питання для самопідготовки:

1. Охарактеризуйте анаболізм і катаболізм білків.

2. Як відбувається синтез білка в організмі?

3. Роль ДНК та РНК в синтезі білка.

4. Розпад амінокислот.

5. Як відбувається синтез сечовини?

ТЕОРЕТИЧНА ЧАСТИНА

Білки складають 18-20 % від загальної маси і близько 50 % сухої маси тіла людини. В організмі масою 70 кг є 12-15 кг білків. На відміну від вуглеводів і жирів, в організмі немає резервних білків. У той же час білки відіграють надзвичайно важливі функції в організмі (пластична, каталітична, енергетична, деякі білки проявляють властивості гормонів, виконують захисну функцію і т.п.). Це означає, що білки дуже динамічні структури, в організм вони постійно надходять із харчовими продуктами, синтезуються, розкладаються, перетворюються в інші речовини.

Організм може тривалий час обходитись без жирів або вуглеводів, але виключення із раціону білків навіть на короткий час призводить до значних порушень, а іноді – до незворотних патологічних змін. За добу в організмі людини оновлюється близько 400 г білків, тобто стільки розпадається до амінокислот і стільки ж синтезується. Частина амінокислот, утворених при розпаді білків, використовується для біосинтезу нових білків із поповненням енергії у вигляді АТФ або перетворюється в непептидні речовини (аміни, гем, тироксин, холін, таурин тощо). Це означає, що для поповнення втрачених під час метаболізму амінокислот організм повинен постійно одержувати білки з продуктами харчування. Під час травлення в шлунково-кишковому тракті білки розпадаються до амінокислот. Утворені амінокислоти використовуються для синтезу білків організму, а також небілкових азотових речовин.

Оскільки на частку білків і вільних амінокислот припадає більше 95 % всього азоту в організмі, то за азотовим балансом, тобто різницею між кількістю азоту, що надходить з їжею, і кількістю азоту, що виводиться з організму (переважно у вигляді сечовини), можна оцінювати загальний білковий обмін. Розрізняють три види азотового балансу. В дорослої здорової людини при нормальному харчуванні спостерігається азотова рівновага (нульовий азотовий баланс), тобто кількість азоту, що надходить, дорівнює кількості, що виділяється з організму.

Позитивний азотовий баланс буває під час росту організму, вагітності, одужання після виснажливих захворювань. За цих умов кількість азоту, що надходить в організм, більша за кількість азоту, що виводиться з організму, тобто загальна білкова маса в організмі збільшується.

Негативний азотовий баланс вказує на збільшення кількості азоту, що виводиться з організму, порівняно з надходженням. Він спостерігається в похилому віці, при виснажливих захворюваннях, білковому або повному голодуванні. В цих випадках загальна маса білків в організмі зменшується.

Повне виключення білка з їжі призводить до швидкого розвитку негативного азотового балансу, що виражається щоденною втратою близько 4 г азоту, тобто 25 г білка. Це означає, що за умов виключення білка з їжі та при достатньому надходженні всіх інших харчових продуктів за добу організм тратить близько 25 г тканинних білків. У разі повного голодування втрата білків ще більша, оскільки в такому випадку амінокислоти, що утворюються при розпаді тканинних білків, будуть використовуватися і для забезпечення енергетичних потреб організму. Максимальна кількість азоту, що екскретується за цих умов, складає близько 20 г на день, тобто розкладається близько 125 г білка. Тривале голодування, як і повне голодування, неодмінно призводить до смерті. Наслідки білкового голодування: порушення фізичної і психічної активності, зниження вмісту білків плазми, що спричиняє порушення колоїдно-осмотичної рівноваги, набряки, зниження синтезу білків м'язів, недокрів'я, ослаблення діяльності серця, порушення імунітету.

Як було сказано вище, у дорослої людини при нормальному харчуванні має місце азотова рівновага. Якщо в умовах азотової рівноваги підвищити кількість білка в їжі, то азотова рівновага незабаром відновиться, але вже на вищому рівні. Таким чином, азотова рівновага може встановлюватись при значних коливаннях вмісту білка в їжі. Мінімальна кількість білка в раціоні, достатньому за калорійністю, при якій підтримується азотова рівновага, складає 30-50 г. Оптимальним для підтримання нормального стану дорослого організму є споживання 80-100 г повноцінного білка (при важкій фізичній роботі — 100-150 г). У США потреба білка вираховується з розрахунку 1 г на кілограм маси людини.

Експерименти з міченим ізотопом ¹⁵N амінокислотами показали, що всі білки тіла постійно оновлюються. Швидкість оновлення білків різних структур організму істотно відрізняється. Кількісно її виражають через період напіврозпаду, тобто час, за який розпадається половина білків тіла або певного органа чи навіть окремих білків. Період напіврозпаду білків плазми крові складає близько 10 днів, білків слизової оболонки кишечника – декілька днів, розчинних білків печінки – від хвилин до 20-30 днів, білків-гормонів – від кількох хвилин до тижня і більше. Повільніше оновлюються білки м'язів, мозку, шкіри, сполучної тканини. Різні білки будь-якої тканини чи органа також значно відрізняються за швидкістю оновлення. Наприклад, період напіврозпаду міозину м'язів – 27 тижнів, а деяких ферментів м'язових клітин – години чи декілька днів. Середня величина періоду напіврозпаду для білків всього організму людини складає приблизно 80 днів. Щоденно в організмі людини за умов азотової рівноваги синтезується близько 400 г білків, тобто приблизно у 4 рази більше, ніж споживається із їжею.

Висока швидкість синтезу білка точно зрівноважується швидкістю його розпаду. Регуляція обміну білків здійснюється групою гормонів. Зокрема, інсулін, соматотропін, тироксин, чоловічі й жіночі статеві гормони у фізіологічних умовах стимулюють біосинтез білків. Глюкокортикоїди гальмують синтез білків у більшості тканин, за винятком печінки, і стимулюють використання амінокислот для глюконеогенезу.

Таким чином, на білковий обмін впливають: 1) вік; 2) фізіологічний стан організму, зокрема нервово-гормональний статус; 3) фізичне навантаження; 4) характер харчування (кількісний і якісний склад білків їжі, а також надходження з нею вуглеводів, ліпідів, вітамінів, мінеральних солей).

Метаболізм аміаку. Синтез сечовини

Аміак утворюється у результаті дезамінування амінокислот, амідів, амінів, а також нуклеотидів. Основним джерелом аміаку є окиснення глутамату глутаматдегідрогеназою, що відбувається практично у всіх тканинах організму. Оскільки аміак високотоксична речовина, особливо для нервової системи, у процесі еволюції в організмі людини виробились досконалі механізми його знешкодження. Рівень аміаку у крові в нормі не перевищує 50 мкмоль/л. Токсичність аміаку зумовлена рядом факторів. У тканинах і рідинах організму аміак переважно знаходиться у вигляді катіона амонію (NH₄⁺), що погано проникає через мембрани. Але у рівновазі з NH₄⁺ знаходиться близько 1 % вільного аміаку, що легко проходить через мембрани. У мітохондріях аміак взаємодіє з α-кетоглутаратом у зворотній глутаматдегідрогеназній реакції, даючи глутамат. Високий вміст аміаку стимулює відтік а-кетоглутарату із циклу лимонної кислоти, а отже, зниження мітохондріального окиснення і синтезу АТФ, до чого найбільш чутливі клітини мозку, які забезпечуються енергією майже повністю за рахунок аеробного розпаду глюкози.

Основними кінцевими продуктами метаболізму аміаку у тварин і людини є сечовина, утворення якої відбувається в печінці. Перенос аміаку від периферичних тканин до печінки і нирок здійснюється у вигляді глутаміну. Ця амінокислота утворюється із глутамінової кислоти шляхом приєднання аміаку під дією глутамінсинтетази.

Глутамін є нейтральною нетоксичною сполукою, яка, на відміну від глутамату, легко проходить через клітинні мембрани. У мозку дія глутамінсинтетази поєднується з дією глутаматдегідрогенази, що функціонує переважно у напрямку синтезу глутамату із α-кетоглутарату.

Із мозку глутамін вільно дифундує в кров чи спинномозкову рідину, усуваючи при цьому дві молекули токсичного аміаку.

Глутамінсинтетаза активна і в печінці. Тут вона підтримує внутрішньоклітинну концентрацію аміаку на рівні, що не досягає меж токсичності. У печінці й нирках глутамін під дією глутамінази гідролізується до глутамату і вільного аміаку.

У транспорті аміаку із м'язів до печінки бере участь нейтральна амінокислота – аланін. При інтенсивній м'язовій роботі частина амінокислот шляхом глюконеогенезу перетворюється у глюкозу. За цих умов у м'язах утворюється значна кількість аміаку. Аміак взаємодіє з α-кетоглутаратом, утворюється глутамат. Останній взаємодіє із піруватом, вміст якого за рахунок посилення гліколізу під час роботи підвищується. Відбувається реакція переамінування між піруватом і глутаматом.

Аланін переноситься з кров'ю до печінки, де під дією аланінамінотрансферази передає аміногрупу α-кетоглутарату, а далі з глутамату в глутаматдегідрогеназній реакції звільняється аміак. Із пірувату в печінці ресинтезується глюкоза, яка знову надходить у м'язи.

Циклічний процес синтезу сечовини відкритий Г. Кребсом і К. Хенселайтом у 1932 році. У циклі беруть участь дві амінокислоти, які не входять до складу білків (орнітин і цитрулін), і дві амінокислоти, що містяться у білках (аргінін і аспартат). Кребс і Хенселайт відкрили, що швидкість синтезу сечовини різко зростає, коли у середовище додають орнітин, аргінін чи цитрулін. На основі цих фактів Кребс запропонував схему синтезу сечовини. Цикл складається із 5 реакцій, кожна з яких каталізується окремим ферментом.

У першій реакції із аміаку і діоксиду вуглецю за участю 2 молекул АТФ утворюється макроергічна сполука карбамоїлфосфат. Цю реакцію, що відбувається в матриксі мітохондрій, каталізує карбамоїлфосфатсинтетаза І, регуляторний фермент синтезу сечовини. Активатором ферменту служить N-ацетилглутамат, утворення якого гальмується аргініном. Таким чином, регуляція синтезу карбамоїлфосфату здійснюється за механізмом зворотного зв'язку. Локалізована в цитоплазмі карбамоїлфосфатсинтетаза ІІ каталізує реакцію утворення карбамоїлфосфату не з вільного аміаку, а із глутаміну. Цей фермент постачає карбамоїлфосфат для синтезу піримідинів.

У другій реакції циклу орнітин-карбамоїлтрансфераза каталізує перенесення карбамоїльної групи на орнітин з утворенням цитруліну.

У ході АТФ-залежної реакції цитрулін конденсується з аспарагіновою кислотою, яка служить другим донором аміногрупи з утворенням аргініносукцинату, який далі розщеплюється на аргінін і фумарат. Перший фермент – аргініносукцинатсинтетаза, другий – аргініносукцинатліаза.

На останній стадії циклу фермент аргіназа, який міститься тільки у печінці, каталізує гідроліз аргініну на сечовину й орнітин.

Орнітин може запускати новий оберт циклу утворення сечовини. Таким чином, роль орнітину в цьому циклі аналогічна до ролі оксалоацетату в циклі лимонної кислоти.

Цикл утворення сечовини і цикл лимонної кислоти тісно взаємозв'язані. Так, надходження СО₂ і АТФ, необхідних для утворення сечовини, забезпечується роботою циклу лимонної кислоти. Фумарова кислота, яка утворюється при розщепленні аргініносукцинату, за участю ферментів циклу лимонної кислоти перетворюється через малат в оксалоацетат, а останній у реакції трансамінування з глутаматом знову дає аспартат.

Безпосередніми джерелами атомів азоту молекули сечовини є аміак і аспартат. Обидва вони можуть бути отримані з глутамату: аміак – шляхом окиснювального дезамінування, аспартат – трансамінування. А завдяки трансамінуванню з α-кетоглутаратом усі амінокислоти здатні віддати аміногрупи в сечовину, кінцевий продукт катаболізму амінокислот в організмі людини.

Сечовина є нейтральною нетоксичною водорозчинною сполукою. Вона доставляється кров'ю у нирки і виходить із сечею. За добу з організму людини виділяється в середньому 30 г сечовини, що складає 80-90 % усього азоту в сечі. При коливанні кількості білка в їжі підтримка азотової рівноваги досягається шляхом зміни швидкості утворення сечовини. Так, при багатій білками їжі в печінці підвищується активність амінотрансфераз і зростає кількість ферментів орнітинового циклу. Підвищений розпад білків тіла також супроводжується збільшенням синтезу й секреції сечовини.

При захворюваннях печінки здатність організму знешкоджувати токсичний аміак шляхом утворення нетоксичної сечовини знижується, в крові зростає вміст аміаку (гіперамоніємія), може розвинутись печінкова кома. Зустрічаються вроджені гіперамоніємії внаслідок генетичного дефекту ферментів циклу утворення сечовини. При дефектах перших двох ферментів циклу (карбамоїлфосфатсинтетази і орнітинкарбамоїлтрансферази) у крові зростає концентрація аміаку, а при дефектах інших трьох ферментів – аміаку й проміжних продуктів циклу. Проміжні продукти (цитрулін, аргінін осукцинат, аргінін) виводяться із сечею і можуть бути виявлені при аналізі сечі. Активність дефектних ферментів може бути знижена різною мірою, аж до повної відсутності. Відповідно, різними за величиною будуть гіперамоніємія, накопичення проміжних продуктів і зниження вмісту сечовини в сечі. У деяких випадках може настати смерть протягом перших місяців життя. Якщо дитина виживає, то спостерігається відставання у розумовому розвитку. Обмеження споживання білка з їжею в ранньому дитинстві до мінімальної кількості, достатньої для підтримки росту й розвитку, дозволяє зменшити можливість уражень мозку. Діагноз уроджених порушень встановлюють шляхом визначення вмісту аміаку і проміжних продуктів орнітинового циклу в крові та сечі, а також шляхом визначення активності ферментів у біоптатах печінки. Іноді тривалі головні болі служать єдиним симптомом, що свідчить про підвищення в крові рівня аміаку, зумовлене дефіцитом ферментів, необхідних для синтезу сечовини, або ураженням печінки.

Утворення сечовини в печінці знижується при підвищенні кислотності в організмі (ацидозі), оскільки в таких випадках частина аміаку використовується на нейтралізацію кислотних продуктів і виділяється у вигляді солей амонію. Невелика кількість цих солей виділяється із сечею як нормальний продукт обміну (близько 0,5 г на добу). При ацидозі клітини нирок захоплюють із циркулюючої крові глутамін, зростає активність глутамінази і при гідролізі глутаміну звільняється аміак. Нейтральні молекули аміаку вільно дифундують із клітин епітелію канальців нирок у сечу, де взаємодіють із іонами водню, утворюючи катіони амонію. Останні не здатні вільно проникати через мембрани, завдяки чому вони утворюють амонійні солі з фосфатами та аніонами органічних кислот, які виводяться із сечею. Одночасно цей процес дозволяє економити запаси в організмі іонів натрію, які при відсутності іонів амонію виводились би з аніонами кислоти. Адаптивному збільшенню утворення амонійних солей у відповідь на ацидоз сприяють також підвищений синтез глутаміну в печінці й надходження його в кров, підвищення захоплення глутаміну клітинами нирок, підвищений синтез у нирках глутамінази. При тяжких формах цукрового діабету вміст амонійних солей у сечі зростає в 10 разів і більше.

Основна кількість аміаку утворюється із амінокислот. Зворотний процес, тобто зв'язування аміаку з α-кетоглутаратом у реакції відновного амінування і наступне трансамінування може забезпечити синтез глутамату й інших замінних амінокислот, але в організмі людини потік азоту від амінокислот до аміаку значно переважає протилежний потік. Глутамін виконує функцію транспортної форми аміаку. Утворення й виділення солей амонію служать одним із механізмів регуляції кислотно-лужної рівноваги в організмі. Основний кінцевий продукт азотового обміну в людини, а також ссавців – сечовина. Риби виділяють амінний азот у вигляді вільного аміаку, а птахи і рептилії – сечової кислоти.

ПРАКТИЧНА ЧАСТИНА

Практичне значення роботи: зміна концентрації сечовини залежить від інтенсивності білкового обміну та кількості білка, який поступає з їжею до організму, тому визначення сечовини має велике діагностичне значення

Матеріали і реактиви: 10% розчин трихлороцтової кислоти; 2,5% водний розчин діацетилмонооксиму; 0,25% водний розчин тіосемикарбазиду; розчин хлориду заліза; кольоровий реактив; стандартний розчин сечовини.

Принцип методу: сечовина утворює з діацетилмонооксимом у присутності тіосемикарбазиду і солей заліза в кислому середовищі забарвлену сполуку, інтенсивність забарвлення якої пропорційна вмісту сечовини в сироватці крові.

Хід роботи:

Робота виконується за схемою, відображеною в таблиці 8.

Таблиця 8.

Приготування дослідних та стандартних проб

Перемішують, поміщають в киплячу водяну лазню на 20 хв. Потім охолоджують 2-3 хв. під водопровідною водою. Колориметрують при довжині хвилі 500—560 нм (зелений світлофільтр) проти холостої проби, в кюветі з товщиною шару 10 мм.

Розрахунок проводять за формулою:

,

де X — концентрація сечовини в ммоль/л в сироватці крові;

Е_досл — екстинкція дослідної проби;

Е_ст — екстинкція стандартної проби;

16,65 — концентрація сечовини в стандартному розчині в ммоль/л.

Нормальні величини: 2,5—8,3 ммоль/л.

Зробити висновки:

Контрольні питання:

1. Що таке азотовий баланс організму і як він підтримується?

2. Поясніть поняття «азотовий баланс».

3. Поясніть поняття «азотова рівновага».

4. Охарактеризуйте цикл синтезу сечовини.

5. З яких стадій складається цикл синтезу сечовини?

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ № 11

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: