Визначення білка в сироватці крові

Мета роботи: вивчити, яким чином кров виконує свою дихальну функцію, як підтримується кислотно-основний стан, засвоїти методику визначення білка в сироватці крові.

Питання для самопідготовки:

1. Транспорт кисню кров'ю.

2. Роль еритроцитів.

3. Транспорт вуглекислого газу кров'ю.

4. Буферні системи крові.

5. КОС як головний чинник регулювання дихання.

ТЕОРЕТИЧНА ЧАСТИНА

Транспорт кров’ю кисню

Кров повинна щоденно переносити від легень до тканин приблизно 600 л кисню (27 моль, 850 г). У розчинному стані переноситься незначна кількість кисню, оскільки він малорозчинний у плазмі крові (3 мл O₂/1 л крові). Гемоглобін при повному насиченні киснем зв'язує 1,34 мл O₂ на 1г, а звідси 1 л цільної крові зв'язує приблизно 200 мл O₂, тобто майже в 70 разів більше, ніж розчиненого. Молекула гемоглобіну, що має 4 геми, зв'язує 4 молекули кисню.

Унікальною особливістю зв'язування гемоглобіном кисню є позитивна кооперативна взаємодія між субодиницями, яка проявляється в збільшенні спорідненості Hb із кожною наступною молекулою O₂, тобто після приєднання першої молекули O₂ кожна наступна молекула приєднується швидше. Коли O₂ зв'язується з атомом заліза гему першої субодиниці, її третинна структура змінюється. Ця зміна індукує структурні зміни інших субодиниць, в яких відразу різко підвищується спорідненість із O₂.

Залежність між ступенем насичення мономерного міоглобіну киснем і парціальним тиском (pO₂) виражається кривою, що має вигляд простої гіперболи. Це свідчить про відсутність кооперативного характеру зв'язування (збільшення спорідненості O₂ з іншими мономерами міоглобіну). Міоглобін має набагато більшу спорідненість із киснем, ніж гемоглобін, що дає йому можливість приєднувати O₂, який доставляється в м'язи гемоглобіном. Таким чином, міоглобін пристосований до ефективного зв'язування, запасання киснем і забезпечення ним процесу тканинного дихання в м'язовій тканині.

Крива насичення киснем гемоглобіну має S-подібну (сигмоїдну) форму. При низькому рО₂ (до 10 мм рт.ст.) НЬ має дуже малу спорідненість із О₂, а після зв'язування першої молекули О₂ крива насичення йде різко вгору. При 60 мм рт. ст. рівень насичення гемоглобіну киснем досягає 90 %, після чого знову повільно піднімається до повного насичення. Завдяки таким властивостям гемоглобін добре пристосований до зв'язування кисню в легенях і його звільнення в периферичних тканинах. Рушійною силою перенесення О₂ служить різниця парціального тиску його в повітрі, рідинах і тканинах організму. рО₂ в альвеолярному повітрі дорівнює 100 мм рт. ст., а у венозній крові – 40 мм рт. ст. Завдяки градієнту в 60 мм рт. ст. кисень швидко дифундує через альвеолярну мембрану і в результаті рО₂ артеріальної крові складає близько 95 мм рт. ст. При такому рО₂ Нb насичується киснем приблизно на 96 %. Якщо ж рО₂ альвеолярного повітря буде меншим – до 80-70 мм рт. ст. (наприклад, на висоті), вміст оксигемоглобіну знизиться всього на 1-3 %.

У міжклітинній рідині тканин організму рО₂ складає 35 мм рт.ст. і менше. Під час протікання крові через капіляри оксигемоглобін дисоціює, причому ступінь дисоціації залежить від інтенсивності окиснювальних процесів у тканинах. Кисень дифундує з еритроцитів через плазму в міжклітинну рідину, а потім у клітини тканин, де в мітохондріях перетворюється у воду. У венозній крові в стані спокою рО₂ дорівнює 40 мм рт.ст., а венозний гемоглобін насичений киснем приблизно на 64 %. Таким чином, приблизно одна третина зв'язаного кисню звільняється в тканинах (6,5 мл О₂ із 100 мл крові). При фізичній роботі рО₂ у м'язах знижується до 25-10 мм рт.ст. і гемоглобін віддає більше кисню. Крім того, через працюючий м'яз збільшується кровообіг.

На зв'язування гемоглобіном О₂ впливають, крім рО₂, температура, рН, концентрація СО₂ і 2,3-дифосфогліцерату (ДФГ). Підвищення концентрації Н⁺ і СО₂ знижує спорідненість гемоглобіну з О₂ і навпаки, сприяє звільненню кисню з оксигемоглобіну. Це явище називається ефектом К. Бора. Так само діє підвищення температури і концентрації в еритроцитах ДФГ. Крива насичення гемоглобіну киснем під дією цих факторів зміщується вправо. ДФГ – проміжний продукт гліколізу – знаходиться в еритроцитах і, зв'язуючись з оксигемоглобіном, сприяє дисоціації кисню. Концентрація ДФГ зростає при підйомах на велику висоту (3-4 км над рівнем моря), а також при гіпоксіях, зумовлених патологічними процесами. Збільшення ступеня дисоціації оксигемоглобіну в тканинах буде компенсувати зниження кількості кисню, який зв'язуватиметься гемоглобіном у легенях в умовах гіпоксії.

Транспорт СО₂ (діоксиду вуглецю)

СО₂ утворюється в тканинах (основне джерело – реакції окиснювального декарбоксилювання альфа-кетокислот у матриксі мітохондрій). За добу у фізіологічних умовах легенями виводиться 300-600 л СО₂ (в середньому 480 л або 22 моля). pCО₂ у міжклітинній рідині складає приблизно 50 мм рт. ст., а в артеріальній крові – 40 мм рт. ст. І хоч різниця pCО₂ значно менша від аналогічної для О₂, але коефіцієнт дифузії СО₂ у 30 разів більший і він швидко дифундує з тканин через міжклітинну рідину, стінки капілярів у кров. Вміст СО₂ у венозній крові становить 55-60 об. %, а в артеріальній – 50 об. %. Таким чином, із тканин до легень переноситься 5-10 мл СО₂ на кожні 100 мл крові. У формі розчиненого в плазмі газу транспортується приблизно 6 %. Основна кількість СО₂ переноситься у вигляді гідрокарбонатів, які утворюються внаслідок гідратації СО₂ і дисоціації вугільної кислоти.

Гідратація СО₂ – процес дуже повільний, і тільки в еритроцитах є фермент карбоангідраза, який каталізує цю реакцію. Протони, які звільнюються при дисоціації вугільної кислоти, зв'язуються специфічними амінокислотними залишками гемоглобіну. Це сприяє звільненню кисню з оксигемоглобіну (ефект Бора) в капілярах тканин. Таким чином, дисоціація оксигемоглобіну в тканинах зумовлюється низьким pО₂ в тканинах, зв'язуванням іонів Н⁺, а також прямим приєднанням СО₂ до гемоглобіну.

Уся кількість СО₂, що утворюється в тканинах за добу, еквівалентна 13000 ммоль Н⁺/2 л конц. НСl. Величезна кількість іонів Н⁺ могла би миттєво знизити рН крові й міжклітинної рідини до 1,0, якщо б вони не зв'язувались із гемоглобіном. Дезоксигемоглобін, на відміну від оксигемоглобіну, є слабкою кислотою.

Аніони НСО₃^- виходять за градієнтом концентрації з еритроцитів у плазму, а замість них для збереження електронейтральності в еритроцити надходять іони СІ^-.

Коли венозна кров потрапляє в капіляри легень, О₂ дифундує в еритроцити, утворюється оксигемоглобін, що як сильна кислота дисоціює, звільнюючи іони водню. Гідрокарбонати плазми також надходять у еритроцити, взаємодіють із протонами, з вугільної кислоти під дією карбоангідрази звільняється СО₂, який дифундує в альвеолярне повітря. Переходу СО₂ з еритроцитів в альвеолярний простір сприяють градієнт парціального тиску СО₂ і висока дифузійна здатність.

Як згадувалось вище, гемоглобін безпосередньо зв'язує СО₂, N-кінцевою альфа-аміногрупою кожного із 4-х поліпептидних ланцюгів з утворенням карбгемоглобіну (карбаміногемоглобіну).

Реакція зворотна і в капілярах тканин внаслідок високого рО₂ відбувається зліва направо, а в легенях – у зворотному напрямку. У вигляді карбгемоглобіну переноситься незначна кількість СО₂, яка зменшує спорідненість його з О₂ і навпаки, зв'язування в легенях гемоглобіном кисню зменшує спорідненість його із СО₂.

Таким чином, гемоглобін може зв'язувати по 4 молекули О₂ чи СО₂, приблизно 4 іони Н⁺ й 1 молекулу ДФГ. Зміна концентрації будь-якого з цих 4 лігандів гемоглобіну через зміну конформації молекули білка регулює його спорідненість з іншими лігандами. Завдяки цьому молекула гемоглобіну прекрасно пристосована до здійснення одночасного переносу еритроцитами О₂, СО₂ й іонів Н⁺.

Буферні системи крові

Стала концентрація іонів водню є необхідною умовою життя організму. Кров має слабколужну реакцію. рН артеріальної крові дорівнює 7,4, рН венозної крові – 7,35, а рН в еритроцитах дещо нижча – приблизно 7,2. При зміні рН порушується дія ферментів і настають інші розлади, що можуть призвести до важких ускладнень і смерті. Вважають, що фізіологічні коливання рН відбуваються в межах 0,05-0,07. Стабільність рН крові підтримується буферними системами (гемоглобіновою, гідрокарбонатною, фосфатною) і білками плазми. Найсильнішою є гемоглобінова система, частка якої складає 75 % усієї буферної ємності крові.

Гемоглобінова буферна система складається з оксигемоглобіну (кислої й основної форми) і дезоксигемоглобіну (кислої й основної форми). Гемоглобін, як і інші білки, містить залишки амінокислот, які можуть зв'язувати та звільняти іони Н⁺ (зокрема залишки гістидину). Константа дисоціації іоногенних груп гемоглобіну змінюється залежно від його насичення киснем. рКа для ННbО₂ складає 6,62, а для ННb – 8,18. Таким чином, оксигемоглобін є сильною кислотою, а дезоксигемоглобін – дуже слабкою, слабкішою за вугільну. При рН, що дорівнює значенню рН крові, оксигемоглобін знаходиться у формі основи НbО₂^-, а дезоксигемоглобін – у кислій формі ННb.

Буферна дія гемоглобіну поєднана з транспортом О₂ і СО₂. В капілярах тканин підвищена концентрація іонів Н⁺, викликана дифузією і гідратацією СО₂, нейтралізується завдяки утворенню кислої форми дезоксигемоглобіну.

Процес може бути і не пов'язаний із звільненням кисню, але він здійснюється швидше і більш ефективно компенсує зміну рН, якщо одночасно відбувається дезоксигенація.

У капілярах легень оксигемоглобін як сильна кислота витісняє з гідрокарбонатів вугільну кислоту, яка швидко розпадається на СО₂ і Н₂О. Таким чином, гемоглобін попереджує підлужування крові після звільнення з неї вуглекислоти.

Гідрокарбонатна буферна система (НСО₃^-/Н₂СО₃) ефективно функціонує при рН біля 7,4. Вугільна кислота виконує функцію донора протона, а гідрокарбонат-іон НСО₃^- - акцептора протона. Концентрація недисоційованих молекул Н₂СО₃ в крові незначна і залежить від концентрації розчиненого СО₂, а остання – від парціального тиску СО₂ в альвеолярній газовій суміші.

При рН крові, рівному 7,4, відношення концентрації НСО₃^-/Н₂СО₃ дорівнює 20:1. При надходженні в кров кислих продуктів іони Н⁺ взаємодіють із гідрокарбонатами, утворюється надлишок вугільної кислоти, яка розпадається. СО₂ переходить у газову фазу в легенях і видихається з організму. Це зумовлює повернення НСО₃^-/Н₂СО₃ до норми (20:1), а отже і до відновлення рН 7,4. І навпаки, коли в плазму крові потрапляє якась кількість лужних речовин і рН підвищується, іони ОН- взаємодіють із вугільною кислотою, яка переходить у гідрокарбонат-іон НСО₃^-. Це викликає розчинення в плазмі крові додаткової кількості СО₂, що міститься в газовому просторі легень. Концентрація Н₂СО₃ у плазмі зростає до нормального співвідношення. Гідрокарбонатна буферна система функціонує спільно з гемоглобіновою. Між обома системами встановлюється рівновага і вони спільно забезпечують підтримання сталості рН крові.

Фосфатна буферна система складається з іонів Н₂РО₄^- і НРО₄^2-. Спряжена кислотно-основна пара Н₂РО₄^- - НРО₄^2- має рКа 6,86, тому ця система служить буфером у межах рН 6,1-7,7. Значення її для крові незначне, оскільки вміст фосфатів у крові малий. Важливу роль фосфатна буферна система відіграє в підтримці сталості рН внутрішньоклітинної рідини, що знаходиться в межах 6,9-7,4.

Білки плазми проявляють буферну дію завдяки наявності іоногенних залишків амінокислот. Вклад їх у буферну ємність крові незначний.

Буферні системи складають першу лінію захисту від зміни рН. Додаткові можливості забезпечують діяльність легень і нирок, які усувають з організму СО₂, кислі й лужні продукти. Так, при зниженні рН дихання стимулюється, що призводить до виведення з організму надлишку СО₂ і навпаки, при підвищенні рН частота дихання знижується для зменшення виділення СО₂ легенями. Частота і глибина дихання регулюються дихальним центром, який чутливий до рН і рСО₂ позаклітинної рідини. Нирки при зниженні рН крові виділяють із сечею NаН₂РО₄, солі амонію (NH₄⁺), слабкі кислоти в недисоційованій формі. При підвищенні рН крові нирки збільшують виведення Nа₂НРО₄, NаНСО₃. Якщо буферні системи та механізми дихальної і ниркової регуляції рН не компенсують відхилень за межі фізіологічної норми, настають порушення кислотно-основної рівноваги – ацидоз чи алкалоз. Залежно від механізмів розвитку порушень розрізняють дихальний чи метаболічний алкалоз або ацидоз. При гіпервентиляції легень знижується концентрація Н₂СО₃ в організмі (гіпокапнія), підвищується рН крові, стан називається дихальним алкалозом. Для компенсації нирки виділяють лужну сечу. Гіповентиляція легень (наприклад, при запаленні, набряку легень, бронхіальній астмі) зумовлює збільшення вмісту СО₂ в крові (гіперкапнія), зниження рН, підвищене виведення із сечею кислих продуктів. Стан називається дихальним ацидозом.

Метаболічний ацидоз виникає при значному збільшенні вмісту в крові кетонових тіл (цукровий діабет, голодування), молочної кислоти (гіпоксія м'язів), втраті секретів підшлункової залози і кишечника при діареї. У крові знижується концентрація НСО₃^- і Н₂СО₃, зростає виведення із сечею кислих продуктів і солей амонію. Метаболічний алкалоз настає внаслідок великої втрати іонів водню при тривалому блюванні чи підвищеній затримці в організмі гідрокарбонатів під впливом мінералокортикоїдів.

У клінічній практиці визначають показники кислотно-лужної рівноваги: рН крові й сечі, концентрацію в плазмі іона гідрокарбонату, парціальний тиск СО₂ в крові, надлишок буферних основ цільної крові чи плазми (лужний резерв). Останній показник з'ясовує, скільки ммоль основ можна додати до даної проби крові чи забрати від неї, щоб її рН при рСО₂, рівному 40 мм рт. ст. і температурі 37 °С досягло значення 7,4.

ПРАКТИЧНА ЧАСТИНА

Практичне значення роботи: за допомогою біуретової реакції можна визначити кількість білка сироватки крові, за якою можна виключити такі патологічні стани, як гіпо- і гіперпротеїнемії, які виникають за наявності ряду захворювань.

Матеріали і реактиви: 0,9% розчин хлористого натрію, 0,2н розчин їдкого натру, вільний від вуглекислого газу, біуретовий реактив, 0,5% розчин йодистого калію в 0,2н розчині їдкого натру, робочий розчин біуретового реактиву, стандартний розчин альбуміну (з людської або бичачої сироватки).

Принцип методу: білки реагують в лужному середовищі з сірчанокислою міддю з утворенням сполук, забарвлених в фіолетовий колір (біуретова реакція).

Хід роботи:

До 0,1 мл сироватки додають 5,0 мл робочого розчину біуретового реактиву, змішують, запобігаючи утворенню піни. Через 30 хвилин (і не пізнаше, ніж за 1 годину) вимірюють на ФЕКі в кюветі з товщиною шару 10 мм при довжині хвилі 540-560 нм (зелений світлофільтр), проти контролю.

Контроль: в 5,0 мл робочого розчину біуретового реактиву додають 0,1 мл 0,9% розчину хлористого натрію; далі обробляють, як дослід.

Розрахунок ведуть за калібрувальним графіком.

Побудова калібрувального графіку. Із стандартного розчину готують робочі стандартні розчини, як вказано в таблиці.

Таблиця 17

Методика приготування стандартних розчинів

З кожного розведення беруть по 0,1 мл робочого розчину і додають по 5,0 мл робочого біуретового реактиву; через 30-60 хвилин вимірюють на ФЕКі, як в досліді, проти контролю. За отриманими даними будують калібрувальний графік.

Нормальні величини: 65-85г/л.

Відтворюваність. Коефіцієнт варіації 3%, допустима похибка визначення 10%.

Клініко-діагностичне значення. В патології загального білка сироватки крові можуть зустрічатися: гіпопротеїнемія – зниження концентрації загального білка; гіперпротеїнемія – підвищення концентрації загального білка. Гіпопротеїнемія спостерігається при нефротичному синдромі, ентериті, хронічному панкреатиті, екземах, масивних крововтратах, при затримці води в результаті серцевої декомпенсації, при великих втратах білка з сечею при нефритах, при тривалих запальних захворюваннях, раковій кахексії. Гіперпротеїнемія зустрічається рідше, наприклад, при мієломній хворобі, хворобі Вальденстрема, хронічних запальних захворюваннях, що супроводжуються дегідратацією організму (понос, блювота).

Зробити висновки.

Контрольні питання:

1. Транспорт кров’ю кисню.

2. Транспорт СО₂ (діоксиду вуглецю).

3. Буферні системи крові.

4. Гемоглобінова буферна система.

5. Гідрокарбонатна буферна система.

6. Фосфатна буферна система.

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ № 15

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: