Главная | Случайная
Обратная связь

ТОР 5 статей:

Методические подходы к анализу финансового состояния предприятия

Проблема периодизации русской литературы ХХ века. Краткая характеристика второй половины ХХ века

Ценовые и неценовые факторы

Характеристика шлифовальных кругов и ее маркировка

Служебные части речи. Предлог. Союз. Частицы

КАТЕГОРИИ:






Тема: Фізіологія мікроорганізмів. Живильні середовища для вирощування мікроорганізмів. Культивування мікроорганізмів. Одержання накопичувальних культур




Помощь в написании учебных работ
1500+ квалифицированных специалистов готовы вам помочь

Мета: Ознайомитися з потребами мікроорганізмів у живильних речовинах і принципами складання живильних середовищ для їх вирощування. Приготувати рідкі й густі (натуральні та синтетичні) живильні середовища, засвоїти правила підготовки живильних середовищ до стерилізації. Засвоїти методи одержання накопичувальних культур різноманітних фізіологічних груп мікроорганізмів із подальшим виділенням чистих культур.

Матеріали й устаткування: несхмелене пивне сусло, пептон, агар-агар, дріжджі, картопля, вівсяні пластивці, молоко, сироватка, желатин і інші компоненти для готування живильних середовищ, колби Виноградського, колби Ерленмейєра, мікробіологічні пробірки з ватно-марлевими пробками, циліндри, ваги технічні, електроплитка, скляні палички, піпетки, крейда, NaCl, вата, марля, фільтрувальний папір, лійки, автоклав. Бульби картоплі, сіно, држджі, молоко, пиво, розсіл капусти або огірків, ножиці, конічні колби на 250 мл, мікробіологічні пробірки, крейда, вата, електроплитка, водяна баня, чашки Петрі, фільтрувальний папір.

Мікроорганізми розрізняються за хімічним складом, типу живлення, дихання, способу одержання енергії, розмноження, стійкості до факторів навколишнього середовища. Живлення є найважливішою функцією мікроорганізмів. Як і всім іншим організмам, їм необхідний набір різних хімічних елементів. Для накопичення, виділення, культивування та збереження мікроорганізмів користуються живильними середовищами. До складу цих середовищ включено живильні речовини, що необхідні у здійсненні обміну між бактеріальною клітиною та середовищем. Обмін речовин мікроорганізмів (бактерій) включає два основних процеси – одержання енергії (енергетичний обмін) і біосинтез речовин клітини (конструктивний обмін). Ці два обміни являють собою різні сторони єдиного метаболізму.

Мікроорганізми повинні бути забезпечені джерелом енергії й одержувати ззовні в необхідних кількостях елементи, що входять у їхній склад для здійснення біосинтезу, розмноження і росту. Це – біогенні (С, О, Н, N); зольні елементи (Р, S, K, Mg, Ca, Fe) і мікроелементи, що стимулюють ріст клітинної маси (у малих дозах) – Zn, Mn, B, Cu, Mo, Co і ін.

У мікробіологічній практиці для вирощування мікроорганізмів використовують різноманітні живильні середовища, які за складом поділяють на природні, або натуральні, напівсинтетичні й синтетичні середовища.

Натуральні середовища складаються з продуктів рослинного й тваринного походження – м'яса, молока, картоплі, моркви, овочевих і фруктових соків, молочнокислої сироватки , відварів, екстрактів, отриманих із природних субстратів.

Прикладами натуральних середовищ можуть слугувати:

– м’ясопептонний бульйон, що складається з екстракту м'яса (500 м м'яса на 1 л води), 0,5% NaCl і 1% пептону (продуктів неповного розкладання білка);

– несхмелене пивне сусло, яке приготоване на основі солоду (пророслих зерен ячменю) і містить цукри;

– дріжджове середовище, що складається з екстракту дріжджів (7-10 г сухих дріжджів на 1 л води), до якого додають вуглеводи (1-2%), мінеральні солі К2НРО4 (0,1%); і NaCl (0,5%);

– картопляне середовище – відвар картоплі (200 г картоплі на 1 л води);

– витяжки з ґрунту та ін.

На натуральних середовищах добре розвиваються багато мікроорганізмів, тому що в таких середовищах є, як правило, усі компоненти, необхідні для їх росту.

Для вирощування мікроорганізмів, що використовують органічні форми азоту, найчастіше вживають м’ясопептонні середовища: м’ясопептонний бульйон (МПБ), м’ясопептонний агар (МПА) і м’ясопептонну желатину (МПЖ).

Солодове (несхмелене пивне) сусло – добре середовище для деяких молочнокислих і оцтовокислих бактерій, дріжджів, мікроскопічних грибів і інших представників гетеротрофних організмів. Основні компоненти сусла – вуглеводи та азотвмісні речовини.

Несхмелене пивне сусло, що отримують із пивоварного заводу, розбавляють водою до 6-7° за Баллінгом і використовують для культивування багатьох мікроорганізмів. Якщо готове сусло відсутнє, користуються солодовим середовищем, що готують у такий спосіб. Зернівки ячменя пророщують до накльовування, потім висушують їх при температурі 60-70°С і мелють на кавовому млині. Нагрівають 1 л води до 50°С і, перемішуючи, всипають у неї 250 г меленого солоду. Залишають у воді без нагрівання на 30 хвилин, потім воду нагрівають і підтримують температуру 55-58°С. Час від часу з рідини беруть проби на крохмаль (йодна проба). Коли йодна проба покаже повне оцукрювання крохмалю, сусло фільтрують і потім стерилізують тиском ½ атм протягом 30 хвилин (так само стерилізують готове сусло). Варто мати на увазі, що для культивування дріжджів використовують сусло, яке містить 6-8% цукру , а для молочнокислих бактерій -8-12%, тому у суслі потрібно визначити вміст цукру. Сусло стерилізують температурою 115°С і тиском 0,5 атм. протягом 30 хв.

Для фільтрування агарових середовищ застосовують ватно-марлевий фільтр. Для його готування скляну лійку покрити марлевою серветкою такої величини, щоб кінці серветки були перекинуті через край лійки назовні, потім на марлю покласти шар гігроскопічної вати і змочити фільтр гарячою дистильованою водою. Агаризоване середовище налити на фільтр у гарячому виді. Процес фільтрації здійснювати в нагрітій водяній бані.

Після фільтрації живильні середовища розливають в судини (колби Ерленмейєра ємністю 250 мл). Наливати треба не вище 2/3 висоти судини. Посуд заздалегідь ретельно миють, висушують, закривають ватно-марлевими пробками, що охороняє середовище від зараження мікроорганізмами, які знаходяться в навколишньому повітрі. Тому пробки повинні бути досить щільними, з рівномірним розподілом волокон вати. Не можна обертати пробки судин, що будуть стерилізуватися в автоклаві, целофаном чи іншими матеріалами, що не пропускають пару. Пара повинна обов'язково проникати через пробку в судину, інакше середовища не нагріються до потрібної температури і не простерилізуються. Посуд необхідно заздалегідь простерилізувати, якщо налиті в нього середовища стерилізують текучою парою чи тиском не більш 0,5 атм. Якщо ж живильні середовища стерилізують під тиском вище 1 атм, то попередня стерилізація посуду необов'язкова.

Середовище з агаром нагрівають на киплячій водяній бані до повного його розплавлення. Якщо передбачається вирощування мікроорганізмів на скошеному агаризованому середовищі в пробірках, то кожну пробірку заповнюють середовищем не більш, ніж на 1/3. Для розливання живильних середовищ користуються лійкою. Потрібно стежити за тим, щоб край пробірок чи флаконів не був змочений живильним середовищем, тому що ватно-марлеві пробки можуть приклеїтись до скла під час стерилізації і будуть важко вийматися, ускладнюючи процес роботи.

Поверх ватно-марлевої пробки на колби й флакони варто надягти паперові ковпачки й підписати назву живильного середовища та дату її готування.

Щоб середовище не підсихало, його скошують після стерилізації, перед посівом. Для цього пробірки з розплавленим на киплячій водяній бані середовищем установлюють у похилому положенні і дають середовищу застигти. Скошена агаризоване середовище не повинно доходити до ватяної пробки на 4-6 см. Середовище, що призначено для культивування бактерій у чашках Петрі, розливають по 15-20 мл у пробірки більшого об’єму, ніж для скошеного агаризованого середовища чи стерилізують у колбах. В останньому випадку до стерилізації агар не розплавляють.

Іноді для культивування мікроорганізмів використовують напівсинтетичні середовища:

МПБ із 2 %-ним розчином глюкози; дріжджовий автолізат із солями амонію й вуглеводами у визначеному співвідношенні. Ці середовища широко використовують для одержання вітамінів, антибіотиків, амінокислот і інших продуктів.

Синтетичні середовища, що включають тільки відомі хімічно чисті речовини, у точно зазначених концентраціях: середовище Виноградського для нітрофіксуючих бактерій, глюкозомінеральне середовище для Achromobacter.

Синтетичні середовища бувають простими за складом чи мають великий набір щодо компонентів. Їх широко використовують для вивчення обміну речовин мікроорганізмів.

За призначенням розрізняють елективні й диференційно-діагностичні середовища.

Елективні (виборчі) середовища забезпечують переважний розвиток одного виду чи групи родинних мікроорганізмів: середовище Чапека (для актиноміцетів), середовище Врублевського, Кітта-Тароцци (для анаеробів), МПА з новобіоцином (для сапрофітних стафілокків, стійких до новобіоцину). Диференційно-діагностичні (індикаторні) середовища, що досить добре дозволяють відрізнити одні види мікроорганізмів від інших: середовище Ендо (для кишкових бактерій), вуглеводні середовища, до складу яких входять різні вуглеводи з індикатором.

З фізичного стану (консистенції) живильні середовища розділяються на: рідкі (МПБ), густі (МПА), сипучі (розварене пшоно, висівки, що просочені живильним розчином).

Для з'ясування фізико-біологічних особливостей мікроорганізмів, а також для накопичення їх біомаси чи продуктів обміну найзручніше застосовувати рідкі середовища.

Напіврідкі середовища готують, додаючи 0,1-0,2 % агар-агару. Агар-агар – рослинний колоїд, що одержують із деяких морських водоростей (складається в основному з полісахаридів, включає азотисті речовини).

Сипкі середовища іноді застосовують у промисловій мікробіології. До них відносяться, наприклад, розварене пшоно, висівки, кварцовий пісок, просочені живильними розчинами.

Густі (тверді) середовища використовують для виділення чистих культур (одержання ізольованих колоній), у діагностичних цілях: опис колоній, встановлення характеру росту на скошеному МПА та ін., для збереження культур, для кількісного обліку мікроорганізмів, визначення їх антагоністичних властивостей. Густі середовища готують із рідких, додаючи для згущення агар-агар (1,5-2,5%), желатину (10-15%) чи кремнекислий гель. Найчастіше в мікробіологічній практиці для згущення середовищ використовується агар-агар. Це складний полісахарид, більшість мікроорганізмів не використовують його як живильний субстрат. У воді агар-агар утворює гелі, що плавляться при температурі 100°С, що твердіє при температурі близько 40°С. Желатина – білок, що одержують в процесі виварювання кісток і хрящів тварин. Желатину до рідких середовищ додають у кількості 10 – 15 % (желатиновий гель плавиться при 23 - 26°С).

 

Культивування мікроорганізмів.

Вирощування мікроорганізмів на живильних середовищах називається культивуванням, а розвинені мікроорганізми, отримані від тварини, людини, чи рослини,субстрату зовнішнього середовища, – культурою. Розвиток культури м/о в рідкому середовищі приводить до утворення суспензії або осаду, плівки, на твердому середовищі – колонії. Культивування за умов визначеної температури (у термостаті) називається інкубацією.

У мікробіологічній практиці широко використовуються як чисті культури мікроорганізмів, так і консорціуми.

Для вивчення фізіолого-біологічних особливостей розвитку бактерій, а також для встановлення їх видової приналежності необхідно виділяти чисті культури, що складаються з мікроорганізмів одного виду.

Консорціуми – змішані чи асоціативні культури, що складаються з 2-х і більш мікроорганізмів, між якими існують різні форми взаємин.

Чиста культура мікроорганізмів одного виду, що виділена з визначеного джерела і відрізняється від інших представників виду незначними змінами, називається штамом. Чиста культура мікроорганізмів, що є потомством однієї єдиної клітини, називається клоном.

Виділення чистої культури проводять поетапно:

– одержання накопичувальної культури;

– виділення чистої культури з ізольованих колоній за методом Коха;

– визначення чистоти виділеної культури та вивчення культуральних властивостей;

– ідентифікація мікроорганізмів із різних властивостей: морфологічних, тинкторіальних, біохімічних (ферментативних), антигенних та ін.

Накопичувальними культураминазиваютьсякультури, які складаються переважно з кліток одного виду.

Для одержання мікроорганізмів визначених фізіологічних груп Виноградським запропонована техніка «накопичувальних культур», заснована на використанні елективних (виборчих) середовищ, що забезпечують переважний розвиток визначених бактерій. Інші організми в цих умовах не можуть розмножуватися чи їх ріст буде дуже незначний.

Внесення кліток мікроорганізмів (зразка ґрунту, проби води) у стерильне живильне середовище для одержання накопичувальної чи чистої культури називається посівом чи інокуляцією. Для одержання накопичувальних культур кращим матеріалом для інокуляції слугують субстрати, у яких відбувається їх природне «збагачення».

Елективні умови передбачають низку факторів, наприклад, потреба м/о у живильному субстраті, відношення до кисню, кислотності середовища, температурі, здатність до спороутворення та ін.

Підбираючи оптимальний склад живильного середовища та параметри культивування та інокулюючи середовище якими-небудь природними субстратами, що містять різноманітні м/о, можна одержати накопичувальну культуру організмів, що характеризуються визначеними фізіолого-біохімічними властивостями. З накопичувальних культур виділяють чисту культуру м/о.

 

Порядок виконання роботи

 

1. Ознайомитися з рецептурами різних натуральних і синтетичних живильних середовищ (Додаток 3).

2. Приготувати густе живильне середовище на основі сусла.

Сусло-агар (СА) є прекрасним середовищем для молочнокислих бактерій і дріжджів. Для одержання твердого сусло-агару до пивного сусла додають 2% агару. Середовище стає однорідним безпосередньо в процесі стерилізації в автоклаві. Якщо необхідно приготовлене середовище відразу розлити у пробірки, його попередньо перед стерилізацією розплавляють на водяній бані.

3. Приготувати тверде живильне середовище на основі пептонної води (додати агар-агар із розрахунку 2%).

4. Приготувати м’ясо-пептонний агар (МПА).

5. Приготувати середовища для актиноміцетів.

Натуральне середовище – вівсяний агар (г): Вівсяне борошно (чи пластивці) – 20; агар 20-25; дистильована вода – 1000 мл; сліди солей FeSO4- 0,1; MnCl2 –0,1; ZnSO4 –0,1. Замість дистильованої води і солей можна використовувати водопровідну воду. Для готування середовища вівсяне борошно (чи пластивці) варять у 1 л води 20 хвилин, фільтрують і доводять об’єм до 1 л. Середовище застосовують для збереження й визначення культуральних, а також морфологічних ознак.

Синтетичне середовище – середовище Гаузе (г): крохмаль розчинний – 20; КNO3-1,0; К2НРО4- 0,5; MgSO4·7H2O - 0,5; NaCl - 0,5; FeSO4 – сліди; рН 7,0-7,4; дистильована вода – 1000 мл.

6. Підготувати середовища до стерилізації.

7. Підготувати для стерилізації 4-5 пробірок із водогонною водою (9 мл) і колбу із 90 мл водогонної води.

8. Середовища й воду віддати на стерилізацію.

9. Одержати накопичувальні культури аеробних спороутворюючих бактерій.

а) Одержати культуру сінної палички (Bacillus subtilis).

Для одержання накопичувальної культури сінної палички помістити приблизно 1 –3 г сіна в колбу на 250 мл і залити 20 –50 мл водопровідної води, що нагріта до 40-50°С. Добавити пучку крейди і прокип’ятити впродовж 15-30 хвилин, поки середовище не придбає колір настою міцного чаю – із сіна екстрагуються речовини, які будуть живильним матеріалом для бактерій. Вегетативні клітини й спори більшості бактерій за цей час загинуть. Тільки спори деяких бактерій, в тому числі термостійкі спори Bacillus subtilis, залишаться життєздатними. Відвар розлити в стерильні пробірки, закрити їх ватними пробками та розмістити в термостат із температурою 25-30°С.

Через дві доби на поверхні середовища розвивається білувата плівка Bacillus subtilis, яка через 3-4 доби стає сірувато-зеленою. Інші мікроорганізми в цих умовах проростають рідко та в невеликій кількості.

б) Одержати культуру картопляної палички (Bacillus subtilis var. mesentericus).

Промиті бульби картоплі, не очищаючи, нарізати кільцями. Поверхню їх натерти крейдою для нейтралізації середовища й помістити в чашки Петрі на подвійний шар фільтрувального паперу, змоченого дистильованою водою. Чашки з картопляним середовищем обробити текучою парою вподовж 10 хвилин і поставити в термостат із температурою 27-30°С на 3-4 доби.

На поверхні шматочків картоплі з’являється щільна зморшкувата плівка культури картопляної палички. Забарвлення плівки може бути різною: білувато-сірою, рожевою, жовто-бурою, чорною, що залежить від різновидності культури, яка здебільшого розвивається.

10. Одержати накопичувальну культуру анаеробних спороносних бактерій.

Неочищену картоплю нарізають шматочками, які можуть легко увійти в пробірку, заповнюють стерильну пробірку на 1/3 об’єму, додають пучку крейди і заповнюють водою майже доверху. Пробірки ставлять на водяну баню з температурою 80°С на 10-15 хв. Потім пробірки закривають пробками і переносять у термостат із температурою 25°С. У цих умовах уже через 2-3 дня в рідині виявляють елективну культуру бактерій маслянокислого бродіння – Clostridium pasteurianum. Для переважного розвитку саме їх створюються анаеробні умови, безспорові форми знищуються попереднім нагріванням, добавка крейди нейтралізує кислоти, що утворюються, та сприяє розвитку бактерій.

11. Одержати накопичувальну культуруоцтовокислих бактерій (Acetobacter aceti)аеробних безспорових бактерій.

У стерильну конічну колбу наливають тонкий шар пива (0,5-1,0 см). Товщина шару пива має значення для результату досліду, тому що для оцтовокислих бактерій треба створити аеробні умови. Колби закривають ватяними пробками і ставлять у термостат із температурою 30°С на 5-7 діб.

12. Одержати накопичувальні культури молочнокислих бактерій.

Молочнокислі бактерії з морфологічних властивостей поділяються на молочнокислі палички і молочнокислі стрептококи.

а) Для одержання накопичувальної культури молочнокислих паличок (Lactobacterium plantarum) у стерильні пробірки із солодовим суслом (6-8° за Баллінгом) добавити 12-15% (об’ємних) етанолу 96%-ного і внести 1% розсолу капусти або огірків. Засіяні пробірки помістити в термостат із температурою 30°С.

б) Для виділення молочнокислих стрептококів (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris) свіже молоко наливають у стерильні пробірки і залишають при температурі 30°С для розвитку бактерій. Для подальшого дослідження відбирають пробірки з молоком, в яких утворився згусток раніше, ніж в інших пробірках.

На наступному занятті переконатися в одержанні накопичувальних культур різноманітних мікроорганізмів.

Про одержання накопичувальної культури судять візуально із проявлення ознак росту м/о: помутнінню середовища, появленню плівки, осаду, пігменту, відділенню газів, а також із мікроскопії прижиттєвих і фіксованих мікробіологічних препаратів.

На наступному занятті одержані результати оформити у вигляді таблиці 6.1.

 

Таблиця 6.1. – Характеристика накопичувальних культур

 

Накопичувальна культура Умови культивуван ня Візуальні ознаки росту Морфологічні особливості
         

 

Лабораторна робота № 7







Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

vikidalka.ru - 2015-2022 год. Все права принадлежат их авторам! Нарушение авторских прав | Нарушение персональных данных