Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Некоторые возбудители инфекционных заболеваний со временем открытия антибиотиков мало изменили характер первоначальной чувствительности к этим препаратам (стрептококки группы А, пневмококки, менингококки, бруцеллы, некоторые сальмонеллы).

Вместе с тем, большинство патогенных микробов со временем приобрело устойчивость к широко, подчас неконтролируемо и необоснованно применяемым противомикробным средствам. Наибольшее значение проблема устойчивости микроорганизмов имеет в отношении стафилококков, шигелл, эшерихий, протея, среди которых антибиотикоустойчивые штаммы выделяются с наибольшей частотой.

По степени чувствительности к основным антибиотикам микробы подразделяются на чувствительные, умеренно чувствительные и устойчивые. В группу чувствительных входит большинство штаммов микроорганизмов, рост которых на питательных средах прекращается при использовании концентраций, соответствующих средним терапевтическим дозам антибиотиков. Если он угнетается при применении только максимальных доз препаратов, то такие микроорганизмы умеренно чувствительны к антибиотику. Если подавление роста достигается в опыте в лаборатории лишь при очень высоких концентрациях препарата, которые нельзя создать в организме, то такие возбудители инфекции относятся к устойчивым к антибиотику.

Для определения чувствительности микробов к антибиотикам существует ряд методов: метод последовательных разведений в жидкой питательной среде или питательном агаре, метод диффузии в агар (метод дисков, насыщенных антибиотиками) и ускоренные методы. Метод дисков прост, широко используется, но дает лишь качественный ответ. Более надежным и точным количественным методом является метод последовательных разведений антибиотиков в питательной среде в стандартных условиях опыта. В большинстве случаев корреляция данных лабораторных исследований с клиническими бывает достаточно полной, а терапия - эффективной при изучении в динамике не только клинического течения процесса, но и возможной смены возбудителя или его чувствительности к антибиотикам.

Концентрация антибиотиков в тканях и жидкостях организма, как и их антимикробная активность, относятся к основным параметрам, определяющим эффективность антибиотикотерапии. При ее изучении наиболее широко применяют микробиологические методы исследования, основанные на способности антибиотика задерживать рост тест-микроба.

Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют:

• Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков).

• Метод дисков — качественный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.

• Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов.

Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.

Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10⁶—10⁷ бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.

Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата.Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина — Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024х0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.

Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).

Занятие 11

1)Понятие об инфекции и инфекционном процессе. Факторы, участвующие в формировании инфекционного процесса.

Инфекция – это состоя­ние зараженности, возникающее в результате проникновения м-ов в макроорганизм.

Инфекционный процесс – это динамика взаимодействия между микро- и макроорганизмом.

Возникновение, течение и исход инфекци­онного процесса определяются тремя группа­ми факторов: 1) количественные и качествен­ные характеристики микроба — возбудителя инфекционного процесса; 2) состояние макроорганизма, степень его восприимчивости к микробу; 3) действие физических, химичес­ких и биологических факторов окружающей микроб и макроорганизм внешней среды, которая и обуславливает возможность уста­новления контактов между представителями разных видов, общность территории обита­ния разных видов, пищевые связи, плотность и численность популяций, особенности пере­дачи генетической информации, особенности миграции и т. д. При этом по отношению к человеку под условиями внешней среды прежде всего следует понимать социальные условия его жизнедеятельности. Первые два биологических фактора являются непос­редственными участниками инфекционного процесса, развивающегося в макроорганизме под действием микроба. При этом микроб определяет специфичность инфекционного процесса, а решающий интегральный вклад в форму проявления инфекционного процесса, его длительность, степень тяжести проявлений и исход вносит состояние макроорганизма, пре­жде всего факторы его неспецифической ре­зистентности, на помощь которым приходят факторы специфического приобретенного иммунитета. Третий, экологический, фактор оказывает на инфекционный процесс опос­редованное воздействие, снижая или повы­шая восприимчивость макроорганизма, либо снижая и повышая инфицирующую дозу и вирулентность возбудителя, активируя меха­низмы заражения и соответствующие им пути передачи инфекции, и т. д.

2)Патогенность и вирулентность микроорганизмов. Факторы вирулентности.

Патогенность –это потенциальная способность микроорганизмов вызывать инфекционный процесс, т.е. при естественных для данного вида микроорганизмов условиях заражения проникать в макроорганизм определенного вида, размножаться в нем, вызывать различной степени тяжести нарушения гомеостаза и развитие ответных реакций со стороны макроорганизма.

Для патогенных микроорганизмов характерны нозологическая специфичность и органотропность.

Нозологическая специфичность заключается в том, что каждый вид патогенных микроорганизмов способен вызывать только для него характерный инфекционный процесс, а также симптомокомплекс патологических реакций, в какой бы восприимчивый макроорганизм они ни попали.

Органотропность – это поражение клеток, тканей и органов, наиболее подходящих по своим биохимическим свойствам для жизнеобеспечения данного вида микроорганизмов.

Вирулентность – это степень патогенности, поддается количественной характеристике.

По этому признаку все штаммы данного вида микроорганизма делятся на высоко -, умеренно -, слабо - и авирулентные

В лабораторных условиях о вирулентности возбудителей и силе действия их токсинов судят по величине летальной (LD) и инфицирующей (ID) доз.

Летальная доза – это наименьшее количество живого возбудителя или токсина, вызывающее в определенный срок гибель конкретного количества животных, взятых в опыт (%).

Инфицирующая доза – это минимальное количество живых микробов, способное вызвать инфекционное заболевание у определенного количества животных, взятых в опыт (%).

Dcl (dosis certa letalis) – безусловно смертельная доза, или наименьшее количество живого микроорганизма или его токсина, вызывающего в течение определенного времени гибель 100 % экспериментальных животных, взятых в опыт.

Dlm (dosis letalis minima) - наименьшее количество живого микроорганизма или его токсина, вызывающего в течение определенного времени гибель 95 % экспериментальных животных, взятых в опыт.

LD 50 – наименьшее количество живого микроорганизма или его токсина, вызывающего в течение определенного времени гибель 50 % экспериментальных животных, взятых в опыт.

ID 100 – минимальное количество живых микроорганизмов, вызывающее развитие инфекционного заболевания у 100 % зараженных экспериментальных животных, взятых в опыт.

ID 50 – минимальное количество живых микроорганизмов, вызывающее развитие инфекционного заболевания у 50 % зараженных экспериментальных животных, взятых в опыт.

Наиболее часто используются показатели LD 50 и ID 50.

При постановке такого рода опытов, безусловно, учитываются вид, пол, возраст, вес, условия содержания и кормления экспериментальных животных, что напрямую связано с формированием и активностью неспецифических и специфических защитных факторов. Важнейшее значение имеет способ заражения.

Факторы патогенности (вирулентности):

1) адгезия – способность бактерий прикрепляться к эпителиальным клеткам. Факторами адгезии являются реснички адгезии, адгезивные белки, липополисахариды у грамотрицательных бактерий, тейхоевые кислоты у грамположительных бактерий, у вирусов – специфические структуры белковой или полисахаридной природы;

2) колонизация – способность размножаться на поверхности клеток, что ведет к накоплению бактерий;

3) пенетрация – способность проникать в клетки;

4) инвазия – способность проникать в подлежащие ткани, которая связана с продукцией таких ферментов, как гиалуронидаза и нейраминидаза;

5) агрессия – способность противостоять факторам неспецифической и иммунной защиты организма. К факторам агрессии относят: а) вещества разной природы, входящие в состав поверхностных структур клетки: капсулы, поверхностные белки; б) ферменты (протеаза, коагулаза, фибринолизин, лецитиназа); в) токсины (экзо- и эндотоксины).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: