Методика исследований

В основе проведения анализа лежат химические реакции в результате которых образуются окрашенные соединения (фотометрический ферментативный метод), либо раствор с взвешенными частицами (метод осаждения), и измерение оптической плотности раствора, либо светопоглащенности.

Правила подготовки пациента для проведения биохимических исследований

Материалом для исследования является венозная кровь, которая берется из локтевой вены и помещается в чистую сухую пробирку без антикоагулянтов. Исключением являются отдельные тесты (например, гликозилированный гемоглобин).

Анализ сдается натощак. Между последним приемом пищи и взятием крови должно пройти не менее 8 ч (желательно - не менее 12 ч). Сок, чай, кофе, тем более с сахаром, пить нельзя. Можно пить воду.

Желательно за 1-2 дня до обследования исключить из рациона жирное, жареное и алкоголь. Если накануне состоялось застолье – следует перенести лабораторное исследование на 1-2 дня. За час до взятия крови необходимо воздержаться от курения.

Надо исключить факторы, влияющие на результаты исследований: физическое напряжение (бег, подъем по лестнице), эмоциональное возбуждение. Перед процедурой необходимо отдохнуть 10-15 минут, успокоиться.

Кровь на анализ сдают до начала приема лекарственных препаратов (например, антибактериальных и химиотерапевтических) или не ранее чем через 10-14 дней после их отмены. О приеме лекарственных препаратов необходимо предупредить лечащего врача.

Кровь не следует сдавать после рентгенографии, ректального исследования или физиотерапевтических процедур.

В разных лабораториях могут применяться разные методы исследования и единицы измерения [19].

Ход определения билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом.

Принцип метода: В основу метода положена реакция взаимодействия диазотированной сульфаниловой кислоты со связанным билирубином сыворотки. По интенсивности образующейся окраски судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива, несвязанный билирубин переходит в растворимое диссоциировонное состояние, благодаря чему он так же вызывает окрашивание раствора со смесью диазореактивов. По интенсивности этой окраски фотометрически определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между общим и связанным билирубином находят содержание несвязанного билирубина.

Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять 20 мин, после чего измеряют на фотометре.

Гемолиз сыворотки снижает количество билирубина пропорционально присутствию гемоглобина. Следовательно, сыворотка крови не должна быть гемолизирована.

В 3 пробирки (2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы, как указано в таблице 2.

Таблица 2 – Данные к проведению опыта для определения билирубина

При дальнейшем стоянии окраска не изменяется. Измерение проводят при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы. Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина. Определение рекомендуется приводить сразу же после забора проб, чтобы избежать окисления билирубина на свету.

Ход определения содержания холестерина в сыворотке крови.

Принцип метода: Определение включает два специфических этапа: на первом этапе холестерин хиломикронов, ЛПОНП и ЛПВП специфически удаляется и разрушается в ферментативной реакции. На втором этапе оставшийся холестерин ЛПНП определяется путем ферментативных реакций в присутствии специфических поверхностно-активных агентов для ЛПНП.

К 2,1 мл кислотной смеси медленно по стенке пробирки до­бавляют 0,1 мл плазмы или сыворотки без признаков гемолиза, перемешивают встряхиванием и ставят на 20 минут в термостат при температуре +37°С, затем фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 сантиметров против реактива при длине волны 625 нм.

Для построения калибровочной кривой и расчета необходимо: к 0,05—0,2 мл калибровочного раствора добавляют такое количество кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 мл, перемешивают и выдержи­вают 20 минут при температуре +37°С, так же, как и опытные пробы, а затем фотометрируют. Окраска калибровочной пробы, в которую взято 0,05 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина в плазме 3 ммоль/литр; пробы, в которую взято 0,1 мл, — содержанию 6 ммоль/литр и так далее.

ЛПВП транспортируют холестерин из клеток органов в печень, где происходит его расщепление до жирных кислот и выведение из организма, поэтому снижение ЛПВП <0,9 ммоль/л расценивается как риск развития атеросклероза. ЛПНП, напротив, осуществляют транспортировку холестерина в ткани, поэтому при увеличении концентрации >2,85 ммоль/л являются фактором высокой атерогенности. Для определения степени риска атеросклероза по значениям α- и β-липопротеидов рассчитывается индекс атерогенности (в норме менее 3).

Вычисление коэффициента атерогенности

Когда определяется общий показатель (ОХС), то все значения складываются, что дает не совсем понятную картину реального положения дел. Ведь если даже уровень холестерина высок, соотношение может быть в пользу ЛПВП, и наоборот. Для того чтобы разобраться, нужно определить индекс атерогенности. Формула для его вычисления выглядит так: (ОХС - ЛПВП) / ЛПВП. Обычно важно знать точные значения всех показателей, то есть уровень ЛПВП, ЛПНП, ОХС. Если индекс атерогенности повышен, это говорит об увеличении уровня "плохого" холестерина. ЛПНП откладывают жир на стенках кровеносных артерий, из которого со временем образуются бляшки. Постепенно они могут полностью перекрыть в сосудах просвет и заблокировать движение крови. В ткани перестанут поступать питательные вещества и кислород, что способствует возникновению в них ишемии. В мозге такая ситуация приведет к мозговому инсульту, в сердце - к инфаркту миокарда [21].

Ход определения активности аланинаминотраисферазы (АлАТ).

Принцип метода: Аланинаминотрансфераза катализирует реакцию между L-аланином и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и соль пировиноградной кислоты. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты обладает более высокой оптической плотностью.

В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для исследования АлАТ. Затем добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки и помещают смесь на 30 мин в термостат, для инкубации при +37 °С. После извлечения ее из термостата в содержимое про­бирки доливают 0,5 мл динитрофенил-гидразинового раствора, и про­бы выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре для развития реакции. Затем добавляют 5 мл 0,4 н NaOH и после тща­тельного перемешивания раствора оставляют его при комнатной тем­пературе на 10 мин для развития окраски.

Строят калибровочный график по таблице 3.

Таблица 3 - Данные к построению калибровочного графика для определения активности аминотрансфераз

В сыворотке крови практически здоровых людей активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) составляет 0,1—0,68 ммоль/(ч • л).

Перевод принятых ранее единиц ферментативной активности (норма для АлАТ — 5—30 ед.) в ммоль пировиноградной кислоты на 1 л сыворотки за 1 ч инкубации при +37 °С производят по формулам:

Д • 2/88 — для аланинаминотрансферазы, где Д — показатели активности ферментов, выраженные в старой размерности (единицах ферментативной активности); 88 — коэффици­ент пересчета, численно равный молекулярной массе пировиноградной кислоты.

Оптическую плотность проб измеряют на ФЭКе с зеленым фильтром (530, 500—560 нм) в кювете с шириной слоя 10 мм. Результаты сравнивают с аналогич­ными данными контрольных проб.

Аминотрансферазную активность сыворотки рассчитывают по ка­либровочной кривой [20]. Для статистической характеристики и оценки физиологических данных необходимо сравнение цифровых величин, получаемых при исследовании, с величинами, свойственными практически здоровому организму. Это сравнение позволяет решить вопрос: протекает данный процесс нормально или имеет отклонение от его обычного течения[22].

При инфаркте миокарда в общем анализе крови наблюдается "симптом ножниц". К концу первых суток лейкоциты повышаются (до 10-12*109/л), а к концу недели приходят в норму. СОЭ с 4-5ого дня начинает расти и держится до 20 дней (что отражает белковые сдвиги в крови) [23].

Основной причиной повышения активности и содержания ферментов в сыворотке крови у больных острым инфарктом миокарда является разрушение кардиомиоцитов и выход высвобождающихся клеточных ферментов в кровь.

Аспартатаминотранфераза (АсАТ) (лабораторная норма 8—40 ед.; в единицах СИ: 0,1—0,45 ммоль/(ч•л))

Динамика АсАТ при остром инфаркте миокарда:

•через 24–36 часа от начала инфаркта относительно быстро наступает пик повышения активности;

•через 4–7 суток концентрация АсАТ возвращается к исходному уровню.

Изменение активности АсАТ неспецифично для острого инфаркта миокарда: уровень АсАТ вместе с активностью АлАТ повышается при многих патологических состояниях, в том числе при заболеваниях печени.

При поражениях паренхимы печени в большей степени возрастает активность АлАТ, а при заболеваниях сердца в большей степени возрастает активность АсАТ; при инфаркте миокарда отношение АсАТ/АлАТ (коэффициент Ритиса) больше 1,33, а при заболеваниях печени отношение АсАТ/АлАТ меньше 1,33.

Тропонин (в норме содержание Тропонина I менее 0,07 нг/мл; в крови здоровых людей даже после чрезмерной физической нагрузки уровень тропонина Т не превышает 0,2 – 0,5 нг/мл).

Тропонин представляет собой универсальную для поперечно-полосатой мускулатуры структуру белковой природы, локализующуюся на тонких миофиламентах сократительного аппарата миокардиоцита.

Сам тропониновый комплекс состоит из трех компонентов:

•тропонина С - ответственный за связывание кальция;

•тропонина Т - предназначен для связывания тропомиозина;

•тропонина I - предназначен для ингибирования этих процессов, выше указанных двух процессов.

Тропонин Т и I существуют в специфичных для миокарда изоформах, отличающихся от изоформ скелетных мышц, чем и обусловливается их абсолютная кардиоспецифичность

Динамика тропонинов при остром инфаркте миокарда:

•спустя 4 – 5 часов после гибели кардиомиоцитов вследствие развития необратимых некротических изменений тропонин поступает в периферический кровоток и определяются в венозной крови;

•в первые 12 – 24 часа от момента возникновения острого инфаркта миокарда достигается пик концентрации.

Кардиальные изоформы тропонина длительно сохраняют свое присутствие в периферической крови:

•тропонин I определяется на протяжении 5 – 7 дней;

•тропонин Т определяется до 14 дней.

Присутствие этих изоформ тропонина в крови больного обнаруживается при помощи иммуноферментного анализа с использованием специфических антител.

При нормальном состоянии сердечно-сосудистой системы тропонин не должен определяться в периферическом кровотоке. Его появление – тревожный сигнал о произошедшем некротическом повреждении ткани миокарда [24].

Атеросклероз.

Для характеристики нарушений липидного обмена используют определение:

1. общего количества холестерина и триглицеридов в плазме крови;

2. содержания отдельных классов липопротеидов (ЛНП, ЛОНП, ЛВП);

3. расчет коэффициента атерогенности.

В большинстве случаев этих данных бывает достаточно, чтобы оценить характер и выраженность нарушений липидного обмена, а также степени атерогенности этих нарушений.

Гиперхолестеринемия диагностируется при содержании холестерина в плазме (сыворотке) крови, превышающем 6,2 ммоль/л (240 мг/дл), а гипертриглицеридемия - при концентрации триглицеридов больше 2,3 ммоль/л (200 мг/дл). Сочетание погранично высокого уровня холестерина (5,2-6,2 ммоль/л) и триглицеридов (1,7-2,3 ммоль/л) с другими ферментами может иметь такое же значение в формировании и прогрессировании атеросклероза, как и более высокий уровень этих липидов, но при отсутствии сахарного диабета, ожирения, отягощенной наследственности.

Гиперхолестеринемия, гипертриглицеридемия и комбинированная гиперлипидемия, встречаются не только при атеросклерозе, но и при многих заболеваниях печени, желчевыводящей системы, почек, эндокринной системы. Повышение их уровня при сахарном диабете, нефротическом синдроме, микседеме, обтурационной желтухе, холестатическом синдроме, беременности [25].

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: