Современная классификация микроорганизмов

Представление о месте микроорганизмов среди других живых существ эволюционировало с течением времени от отнесения их к животным или растениям до выделения в три отдельных домена (надцарства, империи). По современным представлениям, микроорганизмы делятся на прокариот и эукариот в зависимости от строения их клеток. Из-за того, что большинство микроорганизмов устроено крайне просто и для их классификации простого описания было недостаточно, исследователи привлекали функциональные характеристики. Как правило, микробиологический объект невозможно классифицировать, не применив совокупность морфофизиологических, биохимических и молекулярно-биологических данных. При этом перечисленные признаки могут иметь неодинаковую значимость.

Существует также более формальная нумерическая таксономия, где все признаки альтернативны и имеют «одинаковый вес». Это позволяет дать количественную оценку степени сходства и различия организмов путем вычисления коэффициентов сходства или соответствия. Для использования нумерической классификации необходимо как можно полнее изучить фенотипические признаки микроорганизма, так как от этого зависит точность помещения его в данную группу.

В настоящее время основным является филогенетический подход к систематике микроорганизмов, который учитывает родственные связи и пути эволюции организмов. В такой классификации иерархия таксонов отражает генеалогическое древо. Однако при отсутствии в большинстве случаев ископаемых остатков микроорганизмов невозможно напрямую установить исторический путь эволюции [19, c. 10 – 11].

На основании исследований профессора Иллинойского университета К. Вёза (C.Woese) сделана попытка перехода к филогенетической классификации микроорганизмов [20,c. 221]. Сравнивают нуклеотидные последовательности 16SрРНК. Эта молекула обладает достаточно большой, но не чрезмерной информацией и считается своеобразным биологическим генетическим «хронометром». На основе множества сравнений с помощью компьютера было построено филогенетическое древо (рисунок 2.1). Одновременно было доказано, что митохондрии и хлоропласты имеют бактериальное симбиотическое происхождение. Анализ 16SрРНК позволяет определить место микроорганизма на филогенетическом древе, а нахождение видового названия ведется традиционными микробиологическими методами. При этом 90 % совпадений указывает на принадлежность к определенному роду, 97 % – к определенному виду. Более точный метод – ДНК – ДНК-гибридизация, который дает более 30 % совпадений в пределах рода и более 70 % – в пределах вида.

Рисунок 2.1

Филогенетическое древо, построенное на основании анализа 16S pРНК [20, c. 223]

В последнее время для более четкой дифференцировки микроорганизмов на уровне рода и вида, когда подходы, основанные на молекулярно-биологических приемах, недостаточны, предлагают использовать полифилетическую таксономию и наряду с определением последовательностей нуклеотидов применять для анализа и другие источники информации многокоординатной таксономии. Термин «полифазная таксономия» был предложен в 1970г. американским профессором-микробиологом Ритой Колвелл для обозначения таксономии, которая включает и объединяет много уровней информации, от молекулярного до экологического. И учитывает несколько определенных, различающихся порций информации, происходящих из негомогенных систем [21, c. 88].

В настоящее время полифазной таксономией обозначают консенсусную таксономию, которая старается использовать всю имеющуюся информацию для выделения консенсусных таксономических групп [21, c. 91].

Минимальные требования для получения полезной полифилетической информации включают:

- предварительный поиск групп схожих штаммов;

- определение филогенетических позиций этих групп;

- измерения различий между группами и их ближайшими соседями;

-сбор различных данных предпочтительно на разных уровнях клеточной организации.

Предлагались и другие подходы для выявления родственных связей микроорганизмов, например, определение последовательности аминокислот в белке цитохрома с, который есть не у всех, и определение полной последовательности ДНК. Такие подходы позволяют сопоставить эволюционные пути развития в более узких таксономических группах.

В настоящее время разрабатывается классификация всех живых существ, в которой выделены три домена (надцарства): Bacteria, Archaea и Eukarya на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК [22, с. 91 – 93].

В домен Eukarya вошли все эукариотические организмы как одноклеточные, так и многоклеточные, включая человека. Группы, содержащие микроскопические объекты:

- водоросли («растущие в воде»), являющиеся одноклеточными, колониальными или многоклеточными фототрофами, осуществляющими оксигенный фотосинтез. Микробиологическими объектами традиционно считаются представители красных, золотистых, диатомовых, эвгленовых и, конечно, зеленых водорослей, а также их лейкоформы, растущие в темноте и потерявшие пигменты;

- грибы, микробиологическими объектами среди которых являются низшие грибы из родов Rhizopus, Penicillium, Aspergillus и т.д., а также дрожжевые анаморфы грибов;

- простейшие, которым до недавнего времени уделяли внимание в связи с их патогенностью для человека (малярийный плазмодий, трипаносомы и т.д.), но сейчас показано, что при выращивании некоторых почвенных и водных простейших микробиологическим способом в виде чистых культур можно получать ценные продукты. Например, Astasia longa при культивировании в ферментере на синтетической среде дает до 20 % от общего количества липидов полиненасыщенной жирной кислоты – арахидоновой [23, c. 47].

Домен Bacteria включает прокариотические микроорганизмы, имеющие типичные признаки бактерий, в частности клеточные оболочки, содержащие пептидогликан.

Сегодня задача быстрой идентификации прокариотных организмов наиболее полно решается с помощью издания «Определитель бактерий», периодически выпускаемого Обществом американских бактериологов с привлечением крупных специалистов в области изучения тех или иных групп бактерий. Первое издание определителя было выпущено в 1923 г. группой американских бактериологов под руководством Д.X. Берги (1860 – 1937 гг.); девятое издание в 4 томах вышло в 1984 – 1989 гг.

В девятом издании «Определителя бактерий» Д.X. Берги все обнаруженные организмы, отнесенные в царство Рrоcаrуоtaе, разделены на 33 группы. Признаки, по которым осуществляется разделение на группы, вынесены в названия групп. Например: грамотрицательные аэробные палочки и кокки (группа 4), анаэробные грамотрицательные кокки (группа 8), грамположительные палочки и кокки, образующие эндоспоры (группа 13), скользящие бактерии, образующие плодовые тела (группа 24). Основная идея классификации по Д.X. Берги – легкость идентификации бактерий [24, с. 19].

Для осуществления этого используют совокупность признаков:

1. Морфологические признаки – величина, форма, характер взаиморасположения.

2. Тинкториальные свойства – способность окрашиваться, различны ми красителями. Особенно важным признаком является отношение к окраске по Граму, которое зависит от структуры и химического состава клеточной стенки бактерий. По этому признаку все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные. Морфологические свойства и отношение к окраске по Граму определяют принадлежность к крупным таксонам – роду, семейству и т.д.

3. Культуральные свойства – особенности роста на жидких и плотных питательных средах.

4. Подвижность бактерий. Различают подвижные (ползающие или скользящие, плавающие) и неподвижные бактерии.

5. Спорообразование – форма и характер расположения споры в клетке.

6. Физиологические свойства – способы углеродного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминоавтотрофы, аминогетеротрофы) питания; тип дыха ния: аэробы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы, микроаэрофилы.

7. Биохимические свойства – способность ферментировать различные углеводы, протеолитическая активность, образование индола, сероводорода, наличие уреазы и других ферментов и т.д.

8. Чувствительность к специфическим бактериофагам.

9. Антигенные свойства. Они зависят от химического состава клеточной стенки и жгутиков бактерий.

10. Химический состав клеточных стенок (содержание и состав основных сахаров и аминокислот).

11. Липидный и жирнокислотный состав. Изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии, которая обладает высокой разделительной способностью и чувствительностью.

12. Белковые спектры. С помощью методов фракционирования (двумерный электрофорез в полиакриламидном геле) разделяют сложные смеси рибосомных, мембранных или внутриклеточных белков и получают электрофореграммы, или белковые спектры, соответствующей фракции данного вида бактерий.

13. Нуклеотидный состав и последовательность нуклеотидов в моле куле ДНК; наличие и характер минорных оснований в ДНК; нуклеотидный состав рибосомальной РНК; последовательность аминокислот в ферментных белках с аналогичными функциями [23, c. 20 – 23].

Для классификации бактерий все более широко используют методы геносистематики (изучение нуклеотидного состава ДНК и наиболее важных характеристик генома: величины, молекулярной массы, объема и других параметров).

В последнем издании «Определителя бактерий» Берги характерен отказ от построения классической иерархической системы классификации. Она заменена списком упомянутых выше групп и сохранилась только фрагментами. Ценность определителя состоит в том, что он представляет собой наиболее полную сводку известных бактериальных форм и самое современное пособие для идентификации бактерий.

В этом же руководстве предложена схема деления царства Рrоcarуotae на высшие таксоны (отделы, классы). В основу деления на отделы положено строение клеточной стенки. Название и краткая характеристика отделов и классов представлены в таблице 2.1.

Таблица 2.1

Основные характеристики высших таксонов царства Proсaryotae

Отметим, что представленная в «Определителе бактерий» Х.Д. Берги система классификации является строго идентификационной и не решает задачи выявления эволюционных связей между прокариотами. В то же время конечной целью является построение такой системы, в основе которой лежали бы родственные связи между прокариотными организмами.

Первая попытка в этом направлении принадлежит С. Орла-Йенсену, который предложил филогенетическую систему бактерий, основанную на физиологических признаках. Важный шаг на пути создания естественной систематики прокариот связан с успехами молекулярной биологии [24, c. 85]. В 60-х гг. XX в. было установлено, что все свойства организма определяются уникальными химическими молекулами – ДНК, поэтому бактерии могут быть классифицированы путем сравнения их геномов. По такому признаку, как генетический материал, оказалось возможным на основании выявления степени сходства делать вывод о степени родства между организмами.

Первоначально для таксономических целей сравнивали молярное содержание суммы гуанина и цитозина (ГЦ) в процентах от общего количества оснований ДНК у разных объектов.

Этот показатель в отношении прокариот колеблется от 25 до 75 %. Однако ГЦ – показатель дает возможность только для грубого сравнения геномов. Если организмы имеют одинаковый нуклеотидный состав ДНК, возможно и сходство и различие между ними, поскольку генетическое кодирование основано не только на определенном содержании оснований в единице кодирования (триплете), но и на их взаимном расположении. Колебания нуклеотидного состава ДНК у эукариотных микроорганизмов (мол. %): грибы – 26 – 70, водоросли – 37 – 68, простейшие – 22 – 68; у высших растений и животных – 35 – 45. Колебания в составе оснований ДНК вирусов приблизительно такие же, как у прокариот. Более тонкий метод оценки генетического сходства организмов – сравнение нуклеотидных последовательностей ДНК из разных источников методом ДНК-ДНК-гибридизации. В целом значение данных о строении ДНК для систематики прокариот огромно, так как позволяет перейти от установления степени сходства к выводам о степени родства между организмами [24, c. 91 – 92].

Помимо анализа молекул ДНК, для установления степени родства между прокариотными организмами разработаны подходы, позволяющие сравнивать продукты отдельных генов, выполняющие в клетке одинаковые функции. Это могут быть белки (ферредоксины, цито хромы и др.) или рРНК. С использованием последних в качестве филогенетических маркеров связано крупное открытие, позволяющее по-новому взглянуть на систему живого мира.

Выбор рРНК для решения проблем эволюционной систематики прокариот оказался удачным по ряду причин: эти молекулы обнаружены у всех клеточных форм жизни, что указывает на их древнейшее происхождение; их функции всегда одинаковы; первичная структура в целом характеризуется высокой консервативностью. Особенностью рРНК является ее нахождение вне сферы действия отбора, поэтому данные молекулы эволюционируют в результате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью, и накопление таких мутаций зависит только от времени. Таким образом, мерой эволюционного расстояния между организмами служит количество нуклеотидных замен в молекулах сравниваемых рРНК [24, c. 101].

Известно, что в рибосомах прокариот и эукариот присутствуют 3 типа рРНК, различающихся молекулярной массой и коэффициентом седиментации. Информационная емкость крупных молекул больше, но их труднее анализировать. Поэтому наиболее удобным оказался анализ молекул рРНК средней величины: 16S (прокариоты) и 18S (эукариоты). К настоящему времени последовательности 16S и й18S рРНК изучены более чем у 400 организмов, принадлежащих к разным царствам живой природы. На основании полученных данных рассчитаны коэффициенты сходства сравниваемых организмов, что привело к неожиданным результатам: выявлены не две группы организмов, различающихся прокариотным и эукариотным типами клеточной организации, а три:

1. Одну образуют все эукариоты: высшие растения, животные, дрожжи, водоросли и т.п. В эту группу не вошли органеллы эукариот (митохондрии, хлоропласты). Таким образом, первая группа представлена ядерно-цитоплазматическим компонентом эукариотных клеток.

2. Ко второй группе, получившей название бактерий, относится подавляющее большинство прокариот. Сюда же попали на основании степени гомологии 16SрРНК митохондрии и хлоропласты эукариотных клеток.

3. В третью группу вошли некоторые малоизученные прокариоты, обитающие в экстремальных условиях: метанобразующие бактерии, экстремальные галофилы и термоацидофилы. Эта группа организмов получила название архебактерий [24, c. 108].

К сравнительно новому домену Archaea относятся микроорганизмы, разделенные на три филума: Euryarchaeota, Crenarchaeota и Korarchaeota. Первый филум объединяет повсеместно распространенные микроорганизмы. Это метаногены – строгие анаэробы, обитающие в донных осадках пресноводных зон, богатых органикой, или в рубце жвачных. Широко распространены также экстремальные галофилы, растущие при высоких концентрациях соли и способные осуществлять особый тип фотосинтеза с помощью бактериородопсина, который на свету работает как протонная помпа. Ко второму филуму относятся микроорганизмы, имеющие очень узкие и специфические места обитания. Это экстремофилы, зависящие от серных соединений, оптимумы рН и температуры роста у которых отличаются экстремальными значениями. Третий филум зарезервирован за представителями некультивируемых прокариот, для которых, однако, известны последовательности генов, кодирующих молекулу 16S рРНК.

Кроме нуклеотидной последовательности 16S рРНК, археи отличаются от бактерий и эукарий рядом существенных признаков:

- Строением мембран и липидов мембран. В обычных липидах глицерол связан сложноэфирной связью с жирными кислотами, у архей – простой эфирной связью с С20-спиртом – фитанолом. Такие эфиры могут образовывать тетрамеры (С40), а цепи фитанола могут содержать пятичленные кольца. Мембрана, образованная из тетрамеров, более ригидна, так как у нее нет внутреннего пространства (рисунок 2.2). Археи могут иметь как обычные бислойные, так и ригидные монослойные мембраны, но чем экстремальнее условия, тем больше монослойных областей находится в мембране. Археи содержат в мембранах 7 – 30 % изопреноидов (в частности, сквалена). Такие же соединения находят в нефтяных отложениях, что свидетельствует о древности этих микроорганизмов.

Рисунок 2.2

Особенности строения мембран и липидов мембран архей [25, с. 58]

А – строение обычных липидов; Б – строение липидов архей; В – тетраметры фитанола; Г – обычный бислой; Д – ригидный монослой.

- Строением клеточных стенок. Муреиновые клеточные стенки, типичные для бактерий не обнаружены. Они представлены либо псевдомуреином (нет N-ацетилмурамовой кислоты), либо белковым S-слоем (структурированным белком, содержащим «кислые» аминокислоты, за счет чего на поверхности клетки создается тонкий слой воды, отталкивающий ионы солей). Еще один вариант организации архей – отсутствие клеточной стенки, когда мембрана почти полностью представлена ригидным монослоем из тетрамеров, усиленным большим количеством пятичленных колец, например, как у Thermoplasma.

- Особенностями метаболизма. ДНК связана с гистонами. Имеет интронные участки. В тРНК архей не найдено риботимина. Трансляция белка не чувствительна к хлорамфениколу (как у бактерий), зато чувствительна к дифтерийному токсину (как у эукариот). У архей найдены уникальные коферменты – метаноптерин, метанофуран, F₄₂₀, F₄₃₀. Автотрофная фиксция углекислоты у архей происходит нециклическим путем (ацетил-КоА-путь). Галофильные археи осуществляют фотосинтез, связанный с функционированием особого белка, бактериородопсина, с ретиналем в качестве простетической группы, по многим свойствам схожего с родопсихном сетчатки зрительного органа животных.

Архей обычно существуют в экстремальных условиях и дают скудный рост. Однако в таких местообитаниях у них мало конкурентов, что позволило им сохраниться до настоящего времени [25, c. 98 – 100].

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: